DNA5’末端標記試劑盒

產(chǎn)品及特點本產(chǎn)品為 DNA 5’末端標記系統(tǒng)，利用 T4 Polynucleotide Kinase（T4 多聚核苷酸激酶）和［γ-32P］ATP 對粘性末端或平末端的 DNA 或 RNA 的 5’ 末端進行高效標記反應。原理如下： 本產(chǎn)品具有下列特點：

1. 使用本試劑盒之前，不需要對 5’末端的磷酸基團進行去磷酸化處理，因 為使用的 kinase 能使 5’末端的磷酸與[γ-32P]ATP 的γ-磷酸進行交換。

2. 合成的單鏈或雙寡核苷酸的 5’末端游離的 OH 基團都能通過 Kinase 反 應被標記（或者只是簡單的磷酸化）。

3. 提供的兩種反應液使交換反應和磷酸化反應都能高效進行，均能得到大于 106 cpm/pmol（5’-end）的比活性。
規(guī)格及成分 成份 編號 熱封袋包裝 
T4 多聚核苷酸激酶（10 U/μL） 131036A 20 μL
5×交換反應緩沖液 131036B 100 μL
10×磷酸緩沖液 131036C 50 μL
Control DNA 131036D 20 μL
使用手冊 1 份

運輸及保存 低溫運輸，-20℃保存，有效期一年。

自備試劑 DNA 片段、［γ-32P］ATP 或其它的標記、未標記的 ATPs、牛小腸堿性磷酸 酶（CIAP）等

使用方法 一、交換反應 1. 實驗前需自備的試劑：7 M 醋酸銨、100%乙醇、70%乙醇等 2. 在微量離心管中制備下列反應液： 成分 加入的體積 自備的 5’磷酸化 DNA 片段 14 μL(≤5 pmoles 的 5′末端) 5×交換反應緩沖液 5 μL [γ -32P] ATP 5 μL T4 多聚核苷酸激酶（10 U/μL） 1 μL 滅菌的超純水 補足到 25 μL 注：5 pmoles 的 5’末端約等于 0.17 μg 的長 100 bp 的雙鏈 DNA。 3. 37℃反應 30 分鐘。 4. 70℃加熱 5～10 分鐘使酶失活。 5. 加入 10 μL 的 7 M CH3COONH4（pH 4.5）。如使用 CH3COONa 做 乙醇沉淀時使其終濃度達 300 mM。 6. 加入 87.5 μL（2.5 倍）的冷無水乙醇，-20℃放置 30～60 分鐘。 7. 離心回收沉淀，用 70%的冷乙醇清洗沉淀，真空干燥。

8. 用適當 Buffer 溶解沉淀。 注：通過第 5～8 步操作幾乎可以除去大部分未反應的[γ-32P] ATP，如要 完全將其除去時，乙醇沉淀后用凝膠過濾等方法精制即可。如需用苯酚抽 提除去蛋白質(zhì)時，請在第 8 步之后進行。

二、磷酸化反應標記 A. 去磷酸化反應 1. 實驗前需自備的試劑：TE 飽和酚/氯仿、

3 M NaCl 、100%乙醇、70% 乙醇、牛小腸堿性磷酸酶（CIAP）等 2. 在微量離心管中制備下列反應液： 成分 加入的體積 自備的 DNA 片段 133 μL(≤10 μg) 1 M Tris-HCl，pH 8.0 15 μL 牛小腸堿性磷酸酶 （CIAP，10~20 U/μL） 2 μL 滅菌的超純水 補足到 150 μL 3. 50℃反應 30 分鐘。

4. 加入 150 μL 的 TE 飽和酚/氯仿/異戊醇（25：24：1），充分混勻。

5. 離心，取上層（水層）移到另一個微量離心管中。

6. 重復操作 4～5。

7. 加入 7.5 μL 的 3 M NaCl（最終濃度 150 mM）。

8. 加入 375 μL（2.5 倍量）的冷無水乙醇，-20℃放置 30～60 分鐘。

9. 離心回收沉淀，用 1 mL 70%的冷乙醇清洗后，沉淀真空干燥。

10. 使用 20 μL 的 TE Buffer 溶解沉淀。