miRNA cDNA鏈合成試劑盒
產(chǎn)品及特點(diǎn)本試劑盒采用在 miRNA 3’末端加多聚 A 尾的方法來(lái)使 miRNA 具有 Poly(A)

尾，之后再使用 Oligo(dT)-Tag 引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，最終合成 miRNA 對(duì)應(yīng)的鏈 cDNA。其反應(yīng)流程如下：本產(chǎn)品具有如下特點(diǎn)：

1. 兩步式操作，先進(jìn)行 Poly(A)加尾，再進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。

2. 只需要 1 ug 的 total RNA。

3. 所得 cDNA 可用于檢測(cè)多種 miRNA，不僅減少了誤差、節(jié)約了樣品，同時(shí)還

實(shí)現(xiàn)了檢測(cè)的高通量。

4. 與 miRNA 熒光定量 PCR 檢測(cè)試劑盒兼容。

5. 特異性好，獨(dú)特的 miRNA 引物及反應(yīng)體系避免了 Pre-miRNA 的非特異擴(kuò)增。
miRNA cDNA鏈合成試劑盒
規(guī)格及成分 成 分 產(chǎn)品編號(hào) 25 次塑料盒包裝
E.coli Poly(A) 聚合酶(5U/ uL) 120509A 10 uL
10×Poly(A) 聚合酶反應(yīng)液 120509B 50 uL
ATP 溶液，1mM 131013 50 uL
Oligo（dT）-Tag 引物（0.5ug/uL） Yw806B 25 uL
MMLV 逆轉(zhuǎn)錄（含 RI） 60906A 50 uL
4×RT Buffer（含 dNTP） 60906B 125 uL
RNase-free 水 80403 1 mL

miRNA cDNA鏈合成試劑盒運(yùn)輸及保存 低溫運(yùn)輸，-20℃保存

使用方法 一、對(duì) miRNA 3' 末端進(jìn)行加 Poly (A)處理

1. 在冰上預(yù)冷 RNase-Free 的反應(yīng)管內(nèi)加入以下試劑至總體積 20 uL。注意需要

最后加入 E.coli Poly(A)聚合酶。

試劑組分 體積

自備的 Total RNA（見(jiàn)注） 1 ug

10× Poly(A)聚合酶反應(yīng)液 2 uL

ATP 溶液，1mM 2 uL

RNase-Free 水 補(bǔ)水至 20 uL

E.coli Poly(A)聚合酶(5 U/ uL) 0.4 uL（2U）

注：在反應(yīng)中使用的 Total RNA 必須含有 miRNA。也可以直接使用 miRNA（建議加入量為 2–5uL，需根據(jù)目的 miRNA 的豐度決定）。

2. 移液器輕輕混勻上述配制的反應(yīng)液，短暫離心后在 37℃反應(yīng) 60 min。所得的反應(yīng)液可以直接進(jìn)行下游實(shí)驗(yàn)（注意：只能把 2uL 直接用于后續(xù)的 RT 反應(yīng)，多于 2uL 則需要先乙醇-乙酸鈉沉淀，再將加尾后的 miRNA 溶于水，然后再取所需量用于 RT。如果不經(jīng)過(guò)沉淀，帶入的殘留的 poly（A）聚合酶反應(yīng)液將會(huì)干擾 RT 反應(yīng)），也可以放置-20℃短暫保存。如需長(zhǎng)期保存建議存放于-80℃。

二、對(duì)帶 Poly (A)尾巴的 miRNA 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)

3. 按照下表設(shè)置 20 uL 體系的 RT 反應(yīng)：

成分 體積

Poly(A) 反應(yīng)產(chǎn)物（來(lái)于上步） 2 uL

RNase-Free 水 10 uL

Oligo（dT）-Tag 引物 1 uL

4×RT Buffer（含 dNTP） 5 uL

MMLV 逆轉(zhuǎn)錄酶（含 RI） 2 uL

4. 移液器輕輕混勻上述配制的反應(yīng)液，短暫離心后在 42℃反應(yīng) 60 min。

5. 70℃保溫 10 min 終止反應(yīng)。

6. 合成的 cDNA 反應(yīng)液可放置于-20℃保存；也可以暫時(shí)冰上放置，立即用于后續(xù)的熒光 PCR 定量檢測(cè)，不需要純化。