cDNA第二鏈合成試劑盒
產(chǎn)品及特點(diǎn)cDNA 第二鏈合成的原理是用 RNase H 使 RNA-DNA 雜合鏈中的 RNA 產(chǎn)生切口，再用 DNA Polymerase I 通過(guò)切口平移(nick translation)反應(yīng)進(jìn)行RNA 鏈取代合成 cDNA 第二鏈，其示意圖如下:
本產(chǎn)品具有下列特點(diǎn)：
1. 即開(kāi)即用，含有合成 cDNA 第二鏈的所有試劑（包括 RNase H、E.coli DNA聚合酶 1 和 DNA ligase。
2. 一管式操作，不需要每次進(jìn)行純化，不丟失寶貴德樣品。
3. 所得雙鏈 cDNA 可以直接用于后續(xù)的常規(guī) PCR、real-time PCR、cDNA 文庫(kù)構(gòu)建、抑制性差減雜交等。
4. 本試劑盒足夠 30 次 80uL 體系的 cDNA 第二連合成反應(yīng)。
規(guī)格及成分 成分 編號(hào) 十孔盒包裝
5×cDNA 第二鏈合成緩沖液 131005a 250 μL
20×cDNA 第二鏈合成酶混合液 131005b 60 μL
0.5 M EDTA 溶液 130309 60 μL
超純水 100935 1 mL
使用手冊(cè) 131005sc 1 份
運(yùn)輸及保存 低溫運(yùn)輸，-20℃保存，有效期一年。
自備試劑 cDNA 一鏈合成試劑等
使用方法 一、合成 cDNA 一條鏈
本試劑盒不提供 cDNA 一鏈合成試劑，用戶需自備相關(guān)試劑合成 cDNA一鏈。
二、合成 cDNA 第二鏈
1. 在冰浴上向 5uL 已經(jīng)完成 cDNA 一條鏈合成的反應(yīng)體系（逆轉(zhuǎn)錄體系）中依次加入下表試劑，如果多于 5uL，請(qǐng)只取用 5uL：
成分 用量
超純水 25 μL
cDNA 第二鏈合成緩沖液 8 μL
cDNA 第二鏈合成酶混合液 2 μL
共 40uL，輕柔吹打混勻后，短暫離心，16℃保溫 2 小時(shí)
自備的 T4 DNA 聚合酶（見(jiàn)注） 1 μL
輕柔吹打混勻后，16℃繼續(xù)保溫 30 分鐘
0.2M EDTA 溶液 2 μL
注：克隆雙鏈 cDNA 一般需要平末端化，需要此步處理。PCR、SSH 等后續(xù)處
理一般不需要把雙鏈 cDNA 平末端化，則可以跳過(guò) T4 DNA 聚合酶處理步驟，
直接用 EDTA 終止反應(yīng)。
2. 電泳 5 μL 檢測(cè) cDNA 質(zhì)量。如果 cDNA 在 0.5-10Kb 的范圍內(nèi)呈模糊一片，則 cDNA 合格。如果沒(méi)看見(jiàn) cDNA 或有其他異常，需查找原因后再繼續(xù)。
3. 所得 cDNA 可以直接用于后續(xù)的常規(guī) PCR、real-time PCR、cDNA 文庫(kù)構(gòu)建、抑制性差減雜交（SSH）等實(shí)驗(yàn)。
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