動物RNAout

產(chǎn)品及特點本產(chǎn)品是類似于 基于異硫氰酸胍/酚/氯仿提取原理的快速總 RNA 提取試劑，可用于從各種動物組織（包括白細胞）和部分植物材料中 快速提取總 RNA。

1. 操作簡單快速，只要 10 分鐘左右，可以全在室溫下進行。

2. RNA 質(zhì)量高，OD260/OD280 一般在 1.9 左右。一般不含用 RT-PCR 可以檢測到的基因組 DNA 污染。

3. 適用于大部分實驗材料，如培養(yǎng)細胞、各種動物材料和少數(shù)植物材料。 植物 RNA 的提取使用天澤基因的植物 RNAOUT。

4. 性價比高于進口 和 TRI Reagent 等同類產(chǎn)品。 
動物RNAout
規(guī)格及成分 成 份 編 號 小立盒包裝
動物 RNAout 3070a 100 mL（廣口棕色玻璃瓶
使用手冊 3070sc 1 份

動物RNAout運輸及保存常溫運輸，4℃保存，有效期一年。 自備試劑 氯仿、異丙醇、75%乙醇、RNase-free 水。 

使用方法

注意：下面的操作步驟是用 1 mL 本產(chǎn)品進行的微量提取的，細胞使用量一 定要準(zhǔn)確，不能超過下述用量，否則將超出本產(chǎn)品的裂解能力，RNA 產(chǎn)量 將急劇降低。如果樣品量大，請按比例增加各成份的用量。RNA 工作環(huán)境 用高效無毒的固相 RNase 清除劑（CAT#：3080）徹底處理。

1. 對貼壁細胞（10 平方厘米）：吸盡培養(yǎng)液，加入 1 mL 的本產(chǎn)品用槍充 分吹打確保細胞全部裂解，然后將裂解液轉(zhuǎn)移至干凈的 1.5 mL 塑料離 心管中，進入第 6 步。

2. 對懸浮細胞（五百萬至一千萬個）：離心收集細胞，吸盡液體，加入 1 mL 本產(chǎn)品，用槍充分吹打確保細胞全部裂解，然后將裂解液轉(zhuǎn)移到干凈的 1.5 mL 塑料離心管中，進入第 6 步。

3. 對新鮮組織（50-100 mg）：將新鮮組織剪切成小塊，放入 10 mL 或 15 mL 塑料離心管中，加入 1 mL 的本產(chǎn)品，用 Polytron 剪切式勻漿 器冰上勻漿 30 秒左右，將勻漿液轉(zhuǎn)移至新的 1.5 mL 塑料離心管中， 進入第 6 步。注意：對肝、脾、胰、腎等細胞分裂十分旺盛的組織（細 胞中含大量正在復(fù)制的 DNA），使用量不要超過 30-50 mg，否則十分 容易產(chǎn)生 DNA 污染。對 10 mg 以下的組織，加入本公司的微量 RNA 助沉劑。

4. 對 RNALOCKER保存的組織（50-100 mg）：先用紙吸去 RNALOCKER液 體后再剪切成小塊，其余操作同第 3 步。RNALOCKER 處理后的組織韌 性很強，勻漿時間需要適當(dāng)延長。

5. 對液氮中保存的組織（50-100 mg）：在研缽中研磨成粉，加入 1 mL 本產(chǎn)品，用槍充分吹打確保細胞全部裂解，然后將裂解液轉(zhuǎn)移到干凈的 1.5 mL 塑料離心管中，進入第 6 步。

6. 在裝有裂解物/勻漿物的 1.5 mL 塑料離心管中加入 0.2 mL 自備氯仿， 振蕩器上充分振蕩混均 30 秒。注意：一定要把官底的溶液震蕩起來， 否則只是液面的振動。

7. 13000-15000 g 室溫離心 3 分鐘。

8. 將上清液（約 0.6 mL）轉(zhuǎn)移到另一干凈的 1.5 mL 塑料離心管中。下 層有機相（藍色）和中間層含有 DNA 和蛋白質(zhì)，避免觸及，否則將產(chǎn) 生蛋白質(zhì)和 DNA 污染。為保險起見，可以留下 50-100uL 上清液不取。

9. 對脂類豐富的組織（如脂肪組織和腦組織），需再重復(fù)氯仿抽提一到兩 次以讓氯仿充分去除脂類分子。

10. 在上清液中加入等體積的異丙醇，振蕩器上振蕩 30 秒混勻。

11. 13000-15000 g 室溫離心 5 分鐘，離心底的側(cè)面將形成 RNA 沉淀。 如果組織使用量低于 10 mg 或需要提高 RNA 回收率，可以將離心時 間延長到 20 或 30 分鐘。 

12. 小心吸棄上清液，注意不要吸棄 RNA 沉淀。

13. 在含 RNA 沉淀的離心管中加入 1mL 75%乙醇，振蕩混勻 30 秒。

14. 13000-15000 g 室溫離心 1 分鐘。

15. 小心吸棄上清液，注意不要吸棄 RNA 沉淀。

16. 重復(fù)第 13-15 的洗滌步驟一次（也可以省略）。

17. 短暫快速離心，用移液槍小心吸棄殘留乙醇(約 50 uL)。注意不要吸棄 RNA 沉淀。此步十分重要，否則殘留的乙醇會影響 RNA 的后續(xù)使用。

18. 室溫放 1-2 分鐘后立即加入 50-100 uL RNase-free 水使 RNA 沉淀溶 解。千萬不要用真空離心法使 RNA 沉淀過于干燥，否則 RNA 將變得 十分難溶。RNA 樣品可以立即使用或存放于-80℃待用。 注意：由于 RNase-free 水沒有主動滅活殘留 RNase 的功能，而任何 方法提取的 RNA 都可能有殘留的 RNase，所以強烈建議客戶使用本公 司推出的具有主動滅活殘留 RNase 功能的、同時跟后續(xù) RT-PCR 等反 應(yīng)兼容的液相 RNase 清除劑（CAT#：3091）。

附一：RNA 完整性的電泳檢測（僅供參考，本產(chǎn)品不含相關(guān)試劑） 如果需要做 Northern 雜交，強烈建議用戶使用甲醛變性膠進行 RNA 電泳，因為非變性膠不能分離所有的 RNA 分子（BioTechniques，28： 414，2000）。如果是簡單檢測，可以使用 TAE 緩沖液或超快核酸電泳液 進 行 常 規(guī)電 泳 ，但 文獻 報 道 必須 使用 RNAon 這 樣 的變 性 上樣 液 （BioTechniques，9：558，1990）。普通 DNA 上樣液不含變性劑，也 沒經(jīng)過去 RNase 處理，所以不要使用，否則 RNA 容易降解。 動物 RNA 電泳后應(yīng)該在 UV 下呈現(xiàn)三條清晰的 rRNA 帶，28S rRNA 條 帶的熒光強度一般比 18S rRNA 條帶的熒光強度強 1.5-2.3 倍。如果這兩 條 rRNA 帶不清晰或比例小于此范圍則表示 RNA 有降解（因為大的 RNA 被酶降解的可能更大）。 

跟動物一樣，植物果實和種子的 RNA 一般有三條電泳帶，但植物葉片 的 RNA 有四條或更多 rRNA 帶，多余的 RNA 來源于葉綠體。

如果電泳發(fā)現(xiàn) RNA 樣品中有 DNA 污染（一般是使用過多樣品造成）， 可分別用天澤基因的非酶 DNA 清除劑或 RNase-free DNase 清除。

附二：RNA 產(chǎn)量和純度測定（僅供參考，本產(chǎn)品不含相關(guān)試劑）

用 pH 在 7.5-8.2 的 TE 緩沖液將 5-10 μL RNA 稀釋 10-20 倍后在 OD260 和 OD260 測光吸收，通過光吸收可以得出 RNA 濃度（1 OD260 的 RNA=40 μg/mL），進而計算出 RNA 的產(chǎn)量（濃度×體積)和產(chǎn)率(RNA 產(chǎn)量/組織用量)。RNA 的產(chǎn)率還隨組織的營養(yǎng)狀態(tài)和組織的種類不同而不 同，一般來說，代謝旺盛的組織(如肝臟和腎臟)RNA 的產(chǎn)率高，代謝不旺盛 的組織(如肌肉和脂肪組織)RNA 的產(chǎn)率低，下面是常見動物組織 RNA 產(chǎn)率: 肌肉，胎盤和腦組織:1-2 μg RNA/mg 組織 肝，胰和腎組織: 5-10 μg RNA/mg 組織 培養(yǎng)細胞: 5-15 μg/10E6 細胞 RNA 的純度通過 OD260/OD280 來確定，一般在 1.8-2.1 之間即算 合格。但即使低于此范圍，一般也不會影響 RT-PCR 等反應(yīng)。

蛋白質(zhì)污染可以通過酚/氯仿抽提一次然后酒精沉淀去除，多糖污染可 以用天澤基因的多糖清除劑去除。 關(guān)聯(lián)產(chǎn)品 RNADOWN、、液相 RNase 清除劑、固相 RNase