產(chǎn)品簡(jiǎn)介

線粒體是細(xì)胞呼吸的主要場(chǎng)所，細(xì)胞活動(dòng)所需的能量主要由在線粒體內(nèi)進(jìn)行的氧化所產(chǎn)生的能量來(lái)供應(yīng)。制備線粒體的關(guān)鍵是保持線粒體的完整性和純度，可通過(guò)分級(jí)分離法獲得，即先低俗出去細(xì)胞核以及細(xì)胞碎片，再進(jìn)行高速梯度離心分離線粒體。

細(xì)胞線粒體分離試劑盒(Cell Mitochondria Isolation Kit)是快速便捷分離培養(yǎng)細(xì)胞中的線粒體的試劑盒，分離線粒體的同時(shí)可以獲得去除線粒體的細(xì)胞漿蛋白，可用于分析細(xì)胞色素 C 等線粒體蛋白向胞漿的釋放，大部分獲得的線粒體都含有完整的內(nèi)膜和外膜，并具有線粒體的生理功能(如檢測(cè)線粒體膜電位)，獲得的蛋白可用于 SDS-PAGE、Western、雙向電泳等蛋白分析。

本試劑盒提供了蛋白酶抑制劑PMSF，使勻漿時(shí)蛋白酶的活性被適當(dāng)抑制，這樣在獲得線粒體的同時(shí)還可以獲得有時(shí)有用的去除了大量線粒體的蛋白，在進(jìn)行蛋白或酶活分析時(shí)可以作為對(duì)照

該試劑盒僅用于科研領(lǐng)域，不宜用于臨床診斷或其他用途。

試劑組分

試劑(A): Mitochondria Lysis buffer 100ml -20℃
試劑(B): Trypan Blue Stain 10ml 4℃ 避光（可選）
試劑(C): Wash buffer 100ml -20℃
試劑(D): Mitochondria Stock buffer 10ml -20℃
試劑(E): Protein Stock buffer(5×) 20ml RT
試劑(F): PMSF(100×) 1.5ml -20℃

有效期： 12 個(gè)月有效。

自備材料：1、 胰蛋白酶；2、 低溫離心機(jī)、勻漿器；3、 PBS；

操作步驟 (僅供參考) ：

1、清洗：用預(yù)冷的 PBS 清洗細(xì)胞 1 次，4℃ 1000g 離心 5min，棄上清。

2、裂解：沉淀用 1～2ml 預(yù)冷的 Mitochondria Lysis buffer 重懸細(xì)胞，冰浴放置 10～15min，可用相差顯微鏡檢測(cè)膨脹的程度。

3、勻漿：把細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至勻漿器中，勻漿 10～20 次。不同細(xì)胞或不同勻漿器所需的勻漿次數(shù)有所不同，需自行優(yōu)化。

4、立即取勻漿液，加入等量 Wash buffer，輕輕顛倒混勻數(shù)次。

5、4℃，1300g 離心 5min 以去除細(xì)胞核、未破碎的細(xì)胞和大的膜碎片。

6、上清液轉(zhuǎn)移至一干凈離心管，4℃ 1000g 離心 5min，重復(fù) 2 次。

7、上清液轉(zhuǎn)移至一干凈離心管，4℃ 12000～15000g 離心 15min，重復(fù) 1 次。

8、棄上清，沉淀為線粒體，如果希望獲得去除線粒體的細(xì)胞漿蛋白，應(yīng)在本步驟中收集上清，并且在收集上清時(shí)注意勿觸及沉淀。隨后把收集的上清 12000g，4℃離心 10min，上清即為去除線粒體的細(xì)胞漿蛋白。獲得的細(xì)胞漿蛋白應(yīng)保存于 1×Protein Stock buffer，即按細(xì)胞漿蛋白：Protein Stock buffer (5×)=4：1比例混合；如果用于雙向電泳，應(yīng)使用恰當(dāng)?shù)谋４嬉骸?/span>

9、保存：棄上清，用適當(dāng)緩沖液懸浮沉淀。如果用于線粒體酶活性或功能的分析，線粒體沉淀應(yīng)重懸于 Mitochondria Stock buffer；如果用于雙向電泳，請(qǐng)使用適當(dāng)?shù)挠糜陔p向電泳的裂解液處理線粒體。

注意事項(xiàng)

1、試劑(如臺(tái)盼藍(lán)染色液)對(duì)于不同實(shí)驗(yàn)不必全部使用，在實(shí)驗(yàn)條件成熟后可以不必使用。

2、如果不是用于制備線粒體蛋白，Mitochondria Lysis buffer 和 Wash buffer 中不必加入 PMSF。如果用于制備線粒體蛋白樣品，Mitochondria Lysis buffer 和 Wash buffer中需添加 PMSF。PMSF 一定要在試劑加入到樣品中前 1～2min 內(nèi)加入，使PMSF的最終濃度為1mM，以免 PMSF在水溶液中很快失效。

3、分離線粒體的所有步驟均需在冰上或 4℃進(jìn)行，所用溶液需冰浴或 4℃預(yù)冷，全部操作時(shí)間盡量控制在 1h 以內(nèi)。

4、通常在分離線粒體時(shí)前后兩次離心速度選取 1000g 和 15000g，如果希望純度更高，但對(duì)線粒體的得率要求不高，前后兩次離心速度可用 2000g 和 6000g。

5、為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。