名稱 Western及IP細(xì)胞裂解液 Cell Lysis Buffer for Western and IP

貨號 100ml

存儲 -20℃保存，12個月有效。

試劑組分 

Western 及 IP 細(xì)胞裂解液----100mL----Store at -20℃

PMSF(100mM)----1.5mL----Store at -20℃（附送）

產(chǎn)品簡介 

Western及IP細(xì)胞裂解液(Cell lysis buffer for Western and IP)，是一種在非變性條件下裂解細(xì)胞的裂解液。本細(xì)胞裂解液裂解的細(xì)胞，可以用于PAGE，Western，免疫沉淀(immunol precipitation，IP)和免疫共沉淀(co-IP)。

Western及IP細(xì)胞裂解液的主要成分為20mM Tris(pH7.5)，150mM NaCl，1% Triton X-100，低濃度sodium pyrophosphate等組成，并含有多種蛋白酶抑制劑成分，可以有效抑制蛋白的降解，并維持原有的蛋白間相互作用。用Western及IP細(xì)胞裂解液裂解得到的蛋白樣品，可以用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度。由于含有較高濃度的Triton X-100等干擾物質(zhì)，不能用Bradford法測定由本裂解液裂解得到樣品的蛋白濃度。

使用說明 

對于培養(yǎng)細(xì)胞樣品：

(一)貼壁培養(yǎng)細(xì)胞

1、 取 Western 及 IP 細(xì)胞裂解液置于室溫溶解混勻，加入 PMSF，使 PMSF 終濃度為 1mM。[根據(jù)使用量，比如取每1ml RIPA 加入10ul PMSF，使PMSF的最終濃度為1mM，混勻備用 （PMSF現(xiàn)用現(xiàn)加）。]

2、 去除貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)液，用 PBS、 NS 或無血清培養(yǎng)液清洗 1 次，低速離心，棄上清，留取沉淀。

3、 按照 6 孔板每孔加入 100～200μl 含有 PMSF 的裂解液的比例，加入 Western 及 IP 細(xì)胞裂解液。移液器輕輕吹打，使裂解液和細(xì)胞充分接觸。通常裂解液作用于細(xì)胞 1～5s內(nèi)，細(xì)胞就會被裂解。

4、 10000～12000g，離心 3～5min(如果用冷凍離心機(jī) 4℃離心效果更佳)，取上清。

5、 進(jìn)行后續(xù)的 SDS-PAGE、 Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。

 裂解液用量說明：通常6孔板每孔細(xì)胞加入100微升裂解液已經(jīng)足夠，但如果細(xì)胞密度非常高可以適當(dāng)加大裂解液的用量到150微升或200微升。

(二)對于懸浮培養(yǎng)細(xì)胞：

1、 取 Western 及 IP 細(xì)胞裂解液置于室溫溶解混勻，加入 PMSF，使 PMSF 終濃度為 1mM。

2、 低速離心懸浮細(xì)胞，棄上清，收集沉淀。

3、 用手指輕彈細(xì)胞，使其松散。按照 6 孔板每孔細(xì)胞加入 100～200μl 含有 PMSF 的裂解液的比例，加入 Western 及 IP 細(xì)胞裂解液。通常 6 孔板每孔細(xì)胞加入 100μl 裂解液已經(jīng)足夠，但如果細(xì)胞密度非常高可以適當(dāng)加大裂解液的用量到 150～200μl，再用手指輕彈以充分裂解細(xì)胞。充分裂解后應(yīng)沒有明顯的細(xì)胞沉淀。

4、 10000～12000g，4℃離心 3～5min(如無低溫離心機(jī)，室溫下離心亦可)，取上清。

5、 進(jìn)行后續(xù)的 PAGE、 Western、免疫沉淀等操作。

(三)組織樣本

1、 取 Western 及 IP 細(xì)胞裂解液置于室溫溶解混勻，加入 PMSF，使 PMSF 終濃度為 1mM。

2、 把組織剪切成細(xì)小的碎片，越小越好。

3、 取在液氮或超低溫冰箱中冷凍 30min 以上的組織，迅速用液氮研磨，研磨過程盡量控制在 1～2min 之內(nèi)，以減少蛋白的降解。

4、 按照每 20mg 組織加入 100～200μl 裂解液的比例，加入含有 PMSF 的裂解液。冰上或 4℃裂解 30～60min。

5、 步驟 3、 4 亦可以采用如下過程：按照每 20mg 組織加入 100～200μl 裂解液的比例加入含有 PMSF 的 Western 及 IP 細(xì)胞裂解液。用玻璃勻漿器或組織研磨器勻漿，直至充分裂解，過程盡量控制在 1～2min 之內(nèi)，以減少蛋白的降解。

6、 按照每 20mg 組織加入 100～200μl 裂解液的比例，加入含有 PMSF 的裂解液。

7、 10000～12000g，4℃離心 10～15min(如無低溫離心機(jī)，室溫下離心亦可)，取上清。

8、 進(jìn)行后續(xù)的 PAGE、 Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。

 注意事項(xiàng) 

1、 去除貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)液時，如果血清中的蛋白沒有干擾，可以不用清洗。

2、 如果裂解不充分可以適當(dāng)增加裂解液的用量，如果需要高濃度的蛋白樣品，可以適當(dāng)減少裂解液的用量。

3、 如果細(xì)胞量較多，必需分裝成 50～100 萬細(xì)胞/離心管，然后再裂解。大團(tuán)的細(xì)胞較難裂解充分，而少量的細(xì)胞由于裂解液容易和細(xì)胞充分接觸，相對比較容易裂解充分。

4、 如果組織樣品本身非常細(xì)小，可以適當(dāng)剪切后直接加入裂解液裂解，通過強(qiáng)烈 Vortex使樣品裂解充分。然后同樣離心取上清，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。直接裂解的優(yōu)點(diǎn)是比較方便，不必使用勻漿器，缺點(diǎn)是不如使用勻漿器那樣裂解得比較充分。

5、 溶解Cell lysis buffer for Western and IP 時，應(yīng)盡量縮短溶解時間，避免裂解液中的有效成分失效。

6、 細(xì)胞裂解的操作步驟，應(yīng)置于冰上或 4℃進(jìn)行。

附言建議 

用于普通的Western、IP或co-IP，我們推薦使用Western及IP細(xì)胞裂解液，該裂解液已被國內(nèi)各大研究機(jī)構(gòu)廣泛使用，用戶普遍反映很好。裂解細(xì)胞或組織后，沒有非常粘滯的透明狀DNA團(tuán)塊形成，不必采用超聲處理等就可以非常理想地用于后續(xù)操作。 另外該裂解液裂解的產(chǎn)物也適合用于磷酸化蛋白的Western檢測。

對于某些特殊蛋白的IP，如果發(fā)現(xiàn)Western及IP細(xì)胞裂解液效果不是非常理想，可以嘗試用RIPA裂解液(強(qiáng)、中或弱)或NP-40裂解液。如果發(fā)現(xiàn)IP的時候背景很高，即非特異的蛋白也被IP下來，則需要選用裂解強(qiáng)度較高的裂解液，例如RIPA裂解液(強(qiáng)或中)。如果發(fā)現(xiàn)目的蛋白無法被IP下來，則說明裂解液的強(qiáng)度過強(qiáng)，可以使用較為溫和的裂解液例如RIPA裂解液(弱)或NP-40裂解液。

對于某些難溶解蛋白的Western，如果發(fā)現(xiàn)Western及IP細(xì)胞裂解液效果不是非常理想，可以嘗試使用裂解強(qiáng)度更高的裂解液例如RIPA裂解液(強(qiáng)、中)或SDS裂解液。

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