產(chǎn)品規(guī)格 (CAT#: AE1030)
LBA4404 Elec: 50μl/支
pCAMBIA2301(control vector,10ng/μl ) 10μl
保存條件(保質(zhì)期): -80℃(12個(gè)月)
LBA4404 Electro感受態(tài)細(xì)胞基因型
Ach5 (rifR) Ti pAL4404 (strepR) Octopine
LBA4404 Electro感受態(tài)細(xì)胞產(chǎn)品說明
LBA4404菌株為Ach5型背景,核基因中含有篩選標(biāo)簽——利福平抗性基因rif,為了便于轉(zhuǎn)化操作,此菌株攜帶一無自身轉(zhuǎn)運(yùn)功能的章魚堿型Ti質(zhì)粒pAL4404,此質(zhì)粒含有vir基因 (vir基因是T-DNA插入植物基因組必需的元件,pAL4404質(zhì)粒自身的T-DNA轉(zhuǎn)移功能被破壞,但可以幫助轉(zhuǎn)入的雙元載體T-DNA順利轉(zhuǎn)移)。 pAL4404型Ti質(zhì)粒含有篩選標(biāo)簽:strep,賦予LBA4404菌株鏈霉素抗性,適用于菸草、番茄、煙草等植物的轉(zhuǎn)基因操作。唯地生物開發(fā)的LBA4404電轉(zhuǎn)感受態(tài)特別適用于大質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化:經(jīng)pCAMBIA2301質(zhì)粒 (size:11633 bp)檢測(cè)轉(zhuǎn)化效率>105 cfu/μg DNA;經(jīng)pCAMBIA2301-ZH質(zhì)粒 (size:40 kd)檢測(cè)轉(zhuǎn)化效率可達(dá)103 cfu/μg DNA。
LBA4404 Electro感受態(tài)細(xì)胞操作方法
1. 0.1 cm電擊杯和杯蓋從儲(chǔ)存液中拿出倒置于干凈的吸水紙上5分鐘,待其瀝干水分,正置5分鐘,使乙醇充分揮發(fā),待乙醇揮發(fā)干凈立即插入冰中,壓實(shí)冰面,電極杯頂離冰面0.5 cm以方便蓋上杯蓋,冰中靜置5分鐘充分降溫。
2. 取-80℃保存的農(nóng)桿菌感受態(tài)插入冰中5分鐘,待其融化,加入0.01-1 μg質(zhì)粒DNA(體積不大于6ul,感受態(tài)轉(zhuǎn)化效率較高,次使用前做預(yù)實(shí)驗(yàn)確定所加質(zhì)粒的量),用手撥打管底混勻,立即插入冰中,用200 μl槍頭將感受態(tài)-質(zhì)粒混合物快速移到電擊杯中,蓋上杯蓋,空管保留待用。
3. 啟動(dòng)電轉(zhuǎn)儀,設(shè)置參數(shù):C=25 μF,PC=200 ohm,V=2400 V(此參數(shù)為Biorad 推薦,使用者也可按所用電轉(zhuǎn)儀推薦的protocol操作),將電擊杯快速放入電轉(zhuǎn)槽中,電擊完成快速插入冰中,加入700 μl無抗生素的LB并轉(zhuǎn)移到感受態(tài)空管中,28℃振蕩培養(yǎng)2~3小時(shí)。
4. 6000 rpm離心一分鐘收菌,留取100 μl左右上清輕輕吹打重懸菌塊涂布于含相應(yīng)抗生素的LB或YEB平板上,倒置放于28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)2-3天
(當(dāng)平板只含有50 μg/ml kan 時(shí),28℃培養(yǎng)48 h即可;平板中同時(shí)加入50 μg/ml kan,20 μg/ml rif 時(shí),需28℃培養(yǎng)60 h;如果使用的平板含有50 μg/ml rif 則需要28℃培養(yǎng)72-90 h)。
備注
1、農(nóng)桿菌相關(guān)抗生素配方:
2、常用農(nóng)桿菌抗性:(R:抗;S:敏感。)
3、LB及YEB配方:
注意事項(xiàng)
1. 加入質(zhì)粒時(shí)體積不應(yīng)大于感受態(tài)體積的1/10;質(zhì)粒不純或存在乙醇等有機(jī)物污染,轉(zhuǎn)化效率急劇下降;質(zhì)粒增大一倍,轉(zhuǎn)化效率下降一個(gè)數(shù)量級(jí)。
2. 混入質(zhì)粒時(shí)應(yīng)輕柔操作。轉(zhuǎn)化高濃度的質(zhì)粒可相應(yīng)減少最終用于涂板的菌量。
3. 平板上陽性克隆密度過大時(shí),由于營(yíng)養(yǎng)不足,陽性克隆生長(zhǎng)變慢,菌落變小,為了獲得大的菌落,應(yīng)減少質(zhì)粒用量。
4. 利福平濃度不應(yīng)高于25 μg/ml,過高的利福平濃度不利于農(nóng)桿菌生長(zhǎng),會(huì)降低其生長(zhǎng)速度和轉(zhuǎn)化效率。本公司感受態(tài)計(jì)算轉(zhuǎn)化效率時(shí)所用平板只含有50 μg/ml kan,若所用平板含有20 μg/ml rif則轉(zhuǎn)化效率降低到1/2。
5. 培養(yǎng)基中加入利福平的目的是防止雜菌生長(zhǎng)、篩選農(nóng)桿菌;根據(jù)所用菌株抗性加入Ti質(zhì)粒篩選抗生素可防止Ti質(zhì)粒丟失,但Ti質(zhì)粒篩選抗生素不利于農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)基因操作,所以一般培養(yǎng)農(nóng)桿菌時(shí)不考慮這些抗生素,Ti質(zhì)粒丟失的概率極低(可以忽略)。
關(guān)鍵字: LBA4404_ELECTRO感受態(tài)細(xì)胞_
上海聯(lián)邁生物工程有限公司(LMAI Bio)是一家經(jīng)營(yíng)生物、儀器、試劑、耗材等科研產(chǎn)品的高新技術(shù)生命科學(xué)公司,在廣大用戶的幫助和支持下,經(jīng)過不懈的努力, 已成為國(guó)內(nèi)生命科學(xué)領(lǐng)域產(chǎn)品的一家供應(yīng)商,代理許多國(guó)際先進(jìn)水平的高科技產(chǎn)品,包括分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、免疫學(xué)、診 斷等多個(gè)研究及應(yīng)用領(lǐng)域。 公司的服務(wù)和業(yè)務(wù)網(wǎng)絡(luò)遍及全國(guó),在同行獲得一致好評(píng)。 特別是生物試劑和細(xì)胞產(chǎn)品更是種類齊全、價(jià)格實(shí)惠,美國(guó)原裝進(jìn)口原代細(xì)胞,專業(yè)培養(yǎng)基,常用傳統(tǒng)培養(yǎng)基,細(xì)胞培養(yǎng)用的相關(guān)試劑,氨基酸,抗生素,維他命類產(chǎn)品品種齊全,試劑耗材種類繁多。 公司的規(guī)模和產(chǎn)品種類日益擴(kuò)大和更新,我們一直秉承著代理優(yōu)質(zhì)品牌的產(chǎn)品,服務(wù)好每一位顧客,將