凋亡因子Caspase系列檢測
一、Caspase 家族及其在細(xì)胞凋亡中的作用
Caspase全稱為含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific proteinase)，是一組存在于細(xì)胞質(zhì)中具有類似結(jié)構(gòu)的蛋白酶，與真核細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，并參與細(xì)胞的生長、分化與凋亡調(diào)節(jié)。Caspase是一類蛋白酶家族，根據(jù)其蛋白酶序列的同源性可分為3個亞族：Caspase-1亞族包括 Caspase-1、4、5、11；Caspase-2亞族包括Caspase-2、9； Caspase-3亞族包括Caspase-3、6、7、8、10。起細(xì)胞凋亡執(zhí)行作用的是caspase-3、6、7。Caspase又分為起始者（initiators）和執(zhí)行者（executioners）兩類，起始Caspase在外來蛋白信號的作用下被切割激活，激活的起始Caspase對執(zhí)行者Caspase進(jìn)行切割并使之激活，被激活的執(zhí)行者Caspase通過對caspase靶蛋白的水解，導(dǎo)致程序性細(xì)胞死亡。
1、凋亡起始者：Caspase 9、8、2、10、11；同性活化——切割自身前體
2、凋亡執(zhí)行者：Caspase 3、6、7；異性活化——切割結(jié)構(gòu)蛋白、功能蛋白
二、Caspase的檢測
嘉美實(shí)驗(yàn)有多年的檢測caspase系列酶的經(jīng)驗(yàn)。下面以檢測caspase-3酶活性為例，介紹caspase的檢測。
1、檢測原理
半胱氨酸蛋白酶caspase家族蛋白的激活是凋亡進(jìn)程中的一個必要的決定性事件。其中caspase-3的激活在凋亡信號傳導(dǎo)的許多途徑中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用。Caspase-3正常以酶原（32KDa）的形式存在于胞漿中，在凋亡的早期階段，它被激活，活化的Caspase-3由兩個大亞基（17KDa）和兩個小亞基（12KDa）組成，裂解相應(yīng)的胞漿胞核底物，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡?；罨腃aspase-3可以剪切特定的氨基酸序列。嘉美實(shí)驗(yàn)用具有高度特異性Caspase-3熒光底物用來檢測Caspase-3 活性。在Caspase的底物多肽(如Caspase-3的底物為DEVD)上標(biāo)記pNA (p-nitroanilide, 對硝基苯胺).當(dāng)活化的Caspase剪切標(biāo)記的底物多肽后, pNA被釋放出來,此時游離的pNA的發(fā)射光譜可用分光光度計或酶標(biāo)儀在400或405nm 檢測,進(jìn)而推知Caspases的活性.
2、實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備
消毒的EP管、槍頭、三蒸水、冰、水浴箱、實(shí)驗(yàn)組及對照組心肌組織、超速低溫離心機(jī)、酶標(biāo)儀、721分光光度計
3、活性測定操作步驟
1）每組試劑組成
共需 2×Reaction buffer 810 ul，配制2×830ul以防不夠，用前加入8.3ul DTT
活性表示為＝樣本OD1－背景OD1（實(shí)驗(yàn)組）/樣本OD2－背景OD2（對照組）
2）操作步驟
（1）從低溫冰箱中取出用錫鉑紙包著的組織（已稱重標(biāo)記好的），取2-3塊（30mg/塊），放在EP管中，一直浸在冰水中。
（2）錫鉑紙剝?nèi)?，組織直接置于EP管中，加裂解buffer（溶后4攝氏度保存）約700ul；冰上EP管中，用小彎剪將心臟組織剪碎，越碎越好；組織、裂解buffer比例：1：10；冰上操作。
（3）開勻漿機(jī)：取幾塊冰塊于小燒杯中，接自來水成冰水液；將EP管置于盛有冰水的小燒杯中，固定于勻漿機(jī)上；先做對照組；將轉(zhuǎn)頭插于組織液面下，打開電源，逐漸調(diào)大速度至max，上下攪動，直至渾濁，基本無小的組織塊為止；調(diào)小速度至零，關(guān)電源，取出轉(zhuǎn)頭，EP管放回冰水底座
用蒸餾水沖洗轉(zhuǎn)頭，液沖至廢燒杯中；依次以同樣方法將樣本組進(jìn)行勻漿。注意：放空轉(zhuǎn)，慢慢加速，別轉(zhuǎn)別上下移動軸。
（4）勻漿后置于離心機(jī)內(nèi)：先設(shè)時間10min，“起動”；緩慢增大離心速度至1000×10r/min；緩慢減小離心速度，降至30×10r/min時，“停機(jī)”燈亮，即可取出；注配平：套管A、B、C、D配平。
（5）取Reaction buffer 6ml，用前加入60ul DTT（稀釋100倍）；吸取上清至小EP管；依次加Reaction buffer、上清、底物至ELISA板，加底物時，每加一次換一個槍頭（因?yàn)橐靹颍蛔ⅲ旱孜锩咳⊥暌淮味家w蓋，避光； 加完底物后，混勻。
（6）水浴箱中孵育90min。
（7）預(yù)熱酶標(biāo)儀30min（提前半小時打開酶標(biāo)儀）。
（8）酶標(biāo)儀上讀取OD值（405nm處測）。
3）測蛋白
（1）需準(zhǔn)備考馬斯亮蘭試劑盒
（2）用剩余的血清測蛋白
（3）樣本管：每管2.1ml考馬斯亮蘭＋35ul血清 （考馬斯亮蘭原液5ul，5倍稀釋）；空白管：2.1ml考馬斯亮蘭。
（4）開蓋調(diào)零，關(guān)蓋調(diào)百，595nm處測定
4）注意事項(xiàng)
（1）提前計算所需Reaction buffer的量，然后用前加入DTT（稀釋100倍）。
（2）DEVD-pNA要避光保存。
關(guān)鍵字： 凋亡因子CASPASE系列檢測_凋亡因子_生化檢測_
北京嘉美臻元生物技術(shù)有限公司（嘉美實(shí)驗(yàn)）是一家專注于生命科學(xué)領(lǐng)域的高科技企業(yè)，公司創(chuàng)立于2005年，由在國內(nèi)科研試劑、實(shí)驗(yàn)技術(shù)、質(zhì)量管理領(lǐng)域有著十幾年從業(yè)經(jīng)驗(yàn)的專業(yè)、專家團(tuán)隊(duì)組建而成；2009年在北京重組，先后成立了北京嘉美諾斯生物科技有限公司（主要開展生物相關(guān)產(chǎn)品進(jìn)、出口業(yè)務(wù)），北京嘉美紐諾生物科技有限公司（主要為大型藥廠、診斷試劑公司提供服務(wù)）。為方便實(shí)驗(yàn)服務(wù)項(xiàng)目開展，成立了北京嘉美臻元生物技術(shù)有限公司，以“嘉美實(shí)驗(yàn)”品牌提供實(shí)驗(yàn)外包服務(wù)。近五年來，公司已為全國各類科研用戶提供了近5000個大大小小的專項(xiàng)實(shí)驗(yàn)外包或整體課題外包項(xiàng)目服務(wù)，實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目涵蓋了生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)的各研究領(lǐng)域。經(jīng)過多年努力，公司已成為