【產(chǎn)品用途】本產(chǎn)品可應(yīng)用于核酸DNA 的快速擴增。

【檢測原理】本產(chǎn)品是基于重組酶介導(dǎo)鏈置換核酸擴增（Recombinase-aid Amplification，RAA）技術(shù)開發(fā)的恒溫核酸擴增檢測試劑，在39℃恒溫條件下特異識別并擴增目標(biāo)樣本的DNA片段，可用Genchek 熒光檢測儀實時監(jiān)控擴增過程，5-20 min 即可完成擴增檢測。

【技術(shù)原理】重組酶介導(dǎo)鏈置換核酸擴增（Recombinase-aid Amplification，RAA），是一種恒溫核酸快速擴增技術(shù)。從細(xì)菌或真菌中 獲得的重組酶在常溫下可與引物DNA緊密結(jié)合，形成重組酶/引物復(fù)合體，侵入DNA雙鏈核酸模板，在侵入位點重組酶將雙鏈打開，同時單鏈結(jié)合蛋白結(jié)合到被重組酶打開的單鏈上，維持雙鏈模板處于開鏈狀態(tài)。重組酶/引物復(fù)合體開始對雙鏈進行掃描，當(dāng)引物在模板上搜索到與之完全匹配的互補序列時，重組酶/引物復(fù)合體解體，DNA聚合酶結(jié)合到引物的3’端，開始合成新鏈。合成的新鏈又可以作為模板，最終擴增產(chǎn)物以指數(shù)級增長，完成靶標(biāo)基因的擴增。經(jīng)過熒光標(biāo)記的探針與擴增產(chǎn)物結(jié)合，當(dāng)探針被核酸外切酶酶切后發(fā)出熒光信號，可對擴增過程進行實時監(jiān)控。本試劑盒具有快速、靈敏度高以及特異性強等優(yōu)點，反應(yīng)組分已混合并冷凍干燥成反應(yīng)干粉，操作簡便，易于保存。

【引物設(shè)計與探針設(shè)計】

引物設(shè)計建議方法：RAA核酸擴增技術(shù)對引物設(shè)計的要求與常規(guī)PCR引物設(shè)計有一定的區(qū)別。由兩條寡核苷酸組成一對引物，分 別特異性識別一個核酸目標(biāo)物的上下游核苷酸序列；引物長度在30-35 nt之間，序列中無回文序列、連續(xù)單堿基重復(fù)序列和內(nèi)部二級結(jié) 構(gòu)區(qū)；引物Tm值不作為設(shè)計時主要考慮因素；最佳引物對需通過試驗優(yōu)化篩選得到，要求其擴增產(chǎn)物為單一條帶，無非特異性擴增和明顯的引物二聚體。

探針設(shè)計建議方法：探針序列不與引物識別位點重疊，長度在46-52nt之間，序列避免回文序列、內(nèi)部二級結(jié)構(gòu)和連續(xù)的重復(fù)堿基； 共有四個修飾位點，距離5’端的≥28nt的中部位置標(biāo)記一個dSpacer（四氫呋喃，THF），作為核酸外切酶的識別位點；THF位點的上游標(biāo)記一個熒光基團，下游標(biāo)記一個淬滅基團，兩個基團的間距為2-4 nt，THF 距離3’末端≥15nt；3’末端標(biāo)記一個修飾基團，例如胺基、磷酸基團、生物素、生物素-TEG 或C3-spacer。

建議：在開展RAA （熒光型）擴增反應(yīng)之前，先進行引物的篩選試驗，以便得到較高的檢測靈敏度。

【產(chǎn)品組成】

【儲存條件及有效期】本產(chǎn)品存儲于-20±5℃、干燥、避光條件下；有效期為12 個月。

【適用儀器】Genchek 系列熒光檢測儀、其他熒光定量PCR 儀（如：ABI 7500 實時熒光定量PCR 儀（軟件要求2.0 以上）、Bio-Rad CFX96 Touch 熒光定量PCR 儀或耶拿qTOWER 實時熒光定量PCR 儀等）。

【檢測步驟】

1. DNA樣本提?。?/span>請參考傳統(tǒng)DNA 提取方法或其他同效商品化試劑盒提取DNA樣本。

2. 樣本檢測

2.1 單管反應(yīng)體系（50μL）：  推薦反應(yīng)體系（模板用量為5μL）：  陽性對照反應(yīng)體系：

反應(yīng)干粉          1 管       反應(yīng)干粉          1 管            反應(yīng)干粉     1 管

A Buffer          25 μL       A Buffer           25 μL           A Buffer     25 μL

上游引物(10 μM)  2.0 μL       上游引物(10 μM)   2.0 μL           C Buffer     4.6 μL

下游引物(10 μM)  2.0 μL       下游引物(10 μM)   2.0 μL           水          12.9 μL

探針(10 μM)        0.6 μL      探針(10 μM)        0.6 μL             陽性對照      5 μL

DNA樣本和水    17.9μL       水               12.9 μL          B Buffer      2.5 μL

B Buffer          2.5μL        DNA樣本         5 μL           

B Buffer          2.5μL          總體積       50.0μL 

 總體積         50.0μL          

總體積          50.0μL                                               

2.2 操作步驟

2.2.1 根據(jù)反應(yīng)數(shù)量，按照反應(yīng)體系配制含有水、A Buffer、上游引物(10 μM)、下游引物(10 μM) 、探針（10μM）的Mix，混合均勻后加入裝有反應(yīng)干粉的檢測單元管中；

2.2.2 向檢測單元管中加入經(jīng)步驟1處理得到的待測DNA樣本；

2.2.3 再向檢測單元管蓋上加入2.5 μL 的B Buffer，蓋上管蓋，上下顛倒輕甩充分混勻5-6次，低速離心10 sec；

（注：本步驟“是否充分混勻”將決定實驗結(jié)果的重復(fù)性）

2.2.4 將檢測單元管放入 Genchek 熒光檢測儀（或其他熒光定量 PCR儀）中，開始檢測。

3. 陽性對照反應(yīng)

3.1 向裝有反應(yīng)干粉的檢測單元管中加入25μL A Buffer、4.6 μL C Buffer和12.9 μL 水；

3.2 向檢測單元管中加入5.0 μL 陽性對照；

3.3 再向檢測單元管蓋上加入2.5 μL 的B Buffer，蓋上管蓋，上下顛倒輕甩充分混勻5-6次，低速離心10 sec；

（注：本步驟“是否充分混勻”將決定實驗結(jié)果的重復(fù)性）

3.4 將檢測單元管放入 Genchek 熒光檢測儀（或其他熒光定量 PCR儀）中，開始檢測。

4. RAA 程序設(shè)定

4.1 Genchek 系列熒光檢測儀：

4.1.1 開機自檢后，點擊“擴增”；

4.1.2 放入反應(yīng)管后點擊“新建”，編輯實驗名稱，然后選擇熒光通道“FAM”并選擇相應(yīng)反應(yīng)孔。點擊“啟動”；

4.1.3 對反應(yīng)孔對應(yīng)的樣本信息進行編輯，完成后點擊“確定”啟動反應(yīng)。

4.2 其他熒光定量PCR儀：反應(yīng)體系為50μL體系，熒光通道選擇FAM通道。

【結(jié)果分析與判定】

1. 結(jié)果分析

1.1 Genchek系列熒光檢測儀：無需自行設(shè)定基線和閾值。

1.2 其他熒光定量 PCR儀：參照具體熒光定量 PCR儀使用說明書進行基線設(shè)定和閾值設(shè)定。

2. 結(jié)果判定

2.1 Genchek 熒光檢測儀：可自動判讀檢測結(jié)果。

2.2 其他熒光定量 PCR儀（注：不同熒光定量 PCR儀的判定標(biāo)準(zhǔn)有所差別，可依據(jù)實際情況進行調(diào)整，以下判定內(nèi)容僅供參考）：

2.2.1 陽性對照：有典型的擴增曲線出現(xiàn)，出峰時間≤15min（Ct值≤30），為有效結(jié)果；

2.2.2 陰性對照：無擴增曲線出現(xiàn)，或出峰時間≥20min（Ct值≥40），為有效結(jié)果；

2.2.3 檢測樣本：有典型的擴增曲線出現(xiàn)，出峰時間≤18min（Ct值≤36）時為陽性；出峰時間＞18min（Ct值＞36）時為陰性。

【注意事項】

1. 在同一核酸提取方法下，不同樣品類型所提取的核酸含量和純度會有明顯差異，導(dǎo)致擴增效率不同；

2. 當(dāng)實驗室環(huán)境、試劑、儀器或配件存在陽性物質(zhì)（例如質(zhì)粒、擴增產(chǎn)物等）污染，或樣本間存在交叉污染的情況，則會影響檢測結(jié) 果準(zhǔn)確性，出現(xiàn)假陽性結(jié)果；

3. 務(wù)必保證試劑保存、配制或運輸?shù)卯?dāng)，否則可能導(dǎo)致試劑檢測性能下降，出現(xiàn)假陰性結(jié)果；

4. 陽性對照核酸應(yīng)盡快使用，避免反復(fù)凍融；

5. 請嚴(yán)格按照本說明書和基因擴增實驗室的管理規(guī)范進行試驗操作；

6. 實驗結(jié)束后，檢測過程中所產(chǎn)生的廢棄物應(yīng)按照相關(guān)規(guī)范進行處理。

相關(guān)產(chǎn)品：