【產(chǎn)品用途】本產(chǎn)品可應(yīng)用于核酸DNA 的快速擴(kuò)增。

【檢測原理】本產(chǎn)品是基于重組酶介導(dǎo)鏈置換核酸擴(kuò)增（Recombinase-aid Amplification，RAA）技術(shù)開發(fā)的恒溫核酸擴(kuò)增檢測試劑，在39℃恒溫條件下特異識別并擴(kuò)增目標(biāo)樣本的DNA片段，用瓊脂糖凝膠電泳檢測判斷。

【技術(shù)原理】重組酶介導(dǎo)鏈置換核酸擴(kuò)增（Recombinase-aid Amplification，RAA），是一種恒溫核酸快速擴(kuò)增技術(shù)。從細(xì)菌或真菌中獲得的重組酶在常溫下可與引物DNA緊密結(jié)合，形成重組酶/引物復(fù)合體，侵入DNA雙鏈核酸模板，在侵入位點(diǎn)重組酶將雙鏈打開，同時(shí)單鏈結(jié)合蛋白結(jié)合到被重組酶打開的單鏈上，維持雙鏈模板處于開鏈狀態(tài)。重組酶/引物復(fù)合體開始對雙鏈進(jìn)行掃描，當(dāng)引物在模板上搜索到與之完全匹配的互補(bǔ)序列時(shí)，重組酶/引物復(fù)合體解體，DNA聚合酶結(jié)合到引物的3’端，開始合成新鏈。合成的新鏈又可以作為模板，最終擴(kuò)增產(chǎn)物以指數(shù)級增長，完成靶標(biāo)基因的擴(kuò)增。本試劑盒具有快速、靈敏度高以及特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，反應(yīng)組分已混合并冷凍干燥成反應(yīng)干粉，操作簡便，易于保存。

【引物設(shè)計(jì)】RAA核酸擴(kuò)增技術(shù)對引物設(shè)計(jì)的要求與常規(guī)PCR引物設(shè)計(jì)有一定的區(qū)別。由兩條寡核苷酸組成一對引物，分別特異性識別一個(gè)核酸目標(biāo)物的上下游核苷酸序列；引物長度在30-35nt之間，序列中無回文序列、連續(xù)單堿基重復(fù)序列和內(nèi)部二級結(jié)構(gòu)區(qū)；引物Tm值不作為設(shè)計(jì)時(shí)主要考慮因素；最佳引物對需通過試驗(yàn)優(yōu)化篩選得到，要求其擴(kuò)增產(chǎn)物為單一條帶，無非特異性擴(kuò)增和明顯的引物二聚體。

建議：在開展RAA（基礎(chǔ)型）擴(kuò)增反應(yīng)之前，先進(jìn)行引物的篩選試驗(yàn)，以便得到較高的檢測靈敏度。

【產(chǎn)品組成】

【儲存條件及有效期】本產(chǎn)品存儲于-20±5℃、干燥、避光條件下；有效期為12個(gè)月。

【適用儀器】恒溫金屬浴、恒溫水浴鍋或恒溫培養(yǎng)箱等。

【檢測步驟】

1. DNA樣本提取：請參考傳統(tǒng)DNA 提取方法或其他同效商品化試劑盒提取DNA樣本。

2. 樣本檢測

2.1 單管反應(yīng)體系（50μL）：  推薦反應(yīng)體系（模板用量為5μL）：  陽性對照反應(yīng)體系：

反應(yīng)干粉          1 管       反應(yīng)干粉          1 管            反應(yīng)干粉     1 管

A Buffer          25 μL       A Buffer           25 μL           A Buffer     25 μL

上游引物(10 μM)  2.0 μL       上游引物(10 μM)   2.0 μL           C Buffer     4.0 μL

下游引物(10 μM)  2.0 μL       下游引物(10 μM)   2.0 μL           水          13.5 μL

DNA樣本和水    18.5μL       水               13.5 μL         陽性對照      5 μL

B Buffer          2.5μL        DNA樣本         5 μL           B Buffer      2.5 μL

B Buffer           2.5μL 

 總體積         50.0μL          總體積       50.0μL 

總體積          50.0μL                                               

2.2 操作步驟

2.2.1 根據(jù)反應(yīng)數(shù)量，按照反應(yīng)體系配制含有水、A Buffer、上游引物(10 μM)、下游引物(10 μM)的 Mix，混合均勻后加入裝有反應(yīng)干粉的檢測單元管中；

2.2.2 向檢測單元管中加入經(jīng)步驟1處理得到的待測DNA樣本；

2.2.3 再向檢測單元管蓋上加入2.5 μL 的B Buffer，蓋上管蓋，上下顛倒輕甩充分混勻5-6次，低速離心10 sec； （注：本步驟“是否充分混勻”將決定實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重復(fù)性）

2.2.4 將檢測單元管放入39℃ 恒溫金屬浴（或恒溫水浴鍋）中，孵育30min。

2.2.5 反應(yīng)結(jié)束后，在檢測單元管中加入50μL酚:氯仿:異戊醇（25:24:1）抽提液，充分混勻后12000rpm/min離心5min，取上清進(jìn)行電泳檢測。（此步驟除去反應(yīng)體系中對電泳結(jié)果有影響的蛋白類成分）

3. 陽性對照反應(yīng)

3.1 向裝有反應(yīng)干粉的檢測單元管中加入25μL A Buffer、4.0 μL C Buffer和13.5 μL 水；

3.2 向檢測單元管中加入5.0 μL 陽性對照；

3.3 再向檢測單元管蓋上加入2.5 μL 的B Buffer，蓋上管蓋，上下顛倒輕甩充分混勻5-6次，低速離心10 sec；

（注：本步驟“是否充分混勻”將決定實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重復(fù)性）

3.4 將檢測單元管放入39℃ 恒溫金屬?。ɑ蚝銣厮″仯┲?，孵育30min。

3.5 反應(yīng)結(jié)束后，在檢測單元管中加入50μL酚:氯仿:異戊醇（25:24:1）抽提液，充分混勻后12000rpm/min離心5min，取上清

進(jìn)行電泳檢測。（此步驟除去反應(yīng)體系中對電泳結(jié)果有影響的蛋白類成分）

【結(jié)果分析與判定】使用凝膠成像儀進(jìn)行圖像采集和分析，對比擴(kuò)增條帶是否與目的片段大小一致。

【注意事項(xiàng)】

1. 在同一核酸提取方法下，不同樣品類型所提取的核酸含量和純度會有明顯差異，導(dǎo)致擴(kuò)增效率不同；

2. 當(dāng)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境、試劑、儀器或配件存在陽性物質(zhì)（例如質(zhì)粒、擴(kuò)增產(chǎn)物等）污染，或樣本間存在交叉污染的情況，則會影響檢測結(jié)果準(zhǔn)確性，出現(xiàn)假陽性結(jié)果；

3. 務(wù)必保證試劑保存、配制或運(yùn)輸?shù)卯?dāng)，否則可能導(dǎo)致試劑檢測性能下降，出現(xiàn)假陰性結(jié)果；

4. 陽性對照核酸應(yīng)盡快使用，避免反復(fù)凍融；

5. 請嚴(yán)格按照本說明書和基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室的管理規(guī)范進(jìn)行試驗(yàn)操作；

6. 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，檢測過程中所產(chǎn)生的廢棄物應(yīng)按照相關(guān)規(guī)范進(jìn)行處理。

相關(guān)產(chǎn)品：