中文名：ROS 活性氧檢測試劑盒

英文名：Reactive Oxygen Species Assay Kit

貨號：R272916

包裝：1000t

存儲溫度：避光,-20°C儲存

產(chǎn)品介紹：

產(chǎn)品組成

產(chǎn)品簡介

活性氧檢測試劑盒（Reactive Oxygen Species Assay Kit）是一種利用熒光探針H2DCFH-DA進行活性氧檢測的試劑盒。H2DCFH-DA本身沒有熒光，可以自由穿過細胞膜，進入細胞內(nèi)后，可以被細胞內(nèi)的酯酶水解生成DCFH。而DCFH不能通透細胞膜，從而使探針很容易被裝載到細胞內(nèi)。細胞內(nèi)的活性氧可以氧化無熒光的DCFH生成有熒光的DCF。檢測DCF的熒光就可以知道細胞內(nèi)活性氧的水平。根據(jù)活細胞中熒光的產(chǎn)生，可以判斷細胞活性氧的含量和變化。用流式細胞儀或熒光顯微鏡可直接觀察，是一種經(jīng)典的組織或活細胞中活性氧檢測方法。本試劑盒提供了活性氧陽性對照試劑Rosup，以便于活性氧的檢測。Rosup是一種混合物，濃度為50mg/mL。Rosup?為活性氧陽性誘導(dǎo)藥物，根據(jù)其熒光信號強度，可分析活性氧的真正水平。

本試劑盒本底低，靈敏度高，線性范圍寬，使用方便。本試劑盒可以測定1000個樣品1000T(96?孔板)。

一套包含96孔板，可使用1000次。
對光敏感，注意避光保存

注意事項

1.?探針裝載后，一定要洗凈殘余的未進入細胞內(nèi)的探針，否則會導(dǎo)致背景較高。

2.?陽性對照Rosup?一般使用濃度為100 μM?（推薦濃度100-400μM，具體依細胞類型而定）。通常刺激后0.5-4h?可觀察到顯著的活性氧水平升高。對于不同的細胞，活性氧陽性對照的效果可能有較大的差別。如果在刺激后30min?內(nèi)觀察不到活性氧的升高，可延長誘導(dǎo)時間或適當提高活性氧陽性對照的濃度。如果活性氧升高得過快，可縮短誘導(dǎo)時間或適當降低活性氧陽性對照的濃度。

3.?對于某些特別的細胞，實驗過程中如果發(fā)現(xiàn)沒有刺激的陰性對照細胞熒光也比較強， 可以按照1:2000-1:5000?稀釋DCFH-DA?， 使DCFH-DA?的終濃度為2-5 μM。探針裝載的時間也可以根據(jù)情況在15-60 min?內(nèi)適當進行調(diào)整。

4.?活性氧陽性對照(Rosup)?僅僅用于作為陽性對照的樣品，并不是在每個樣品中都需加入活性氧陽性對照。

5.?探針裝載完畢并洗凈殘余探針后，可以進行激發(fā)波長的掃描和發(fā)射波長的掃描，以確認探針的裝載情況是否良好。DCF的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜請參考上圖。

6.?盡量縮短探針裝載后到測定所用的時間（刺激時間除外），以減少各種可能的誤差。

7.?為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

8.?定量的話要作標準曲線吧。先做一個不同濃度H2O2氧化DCFA熒光值，做一條標準曲線，X軸為H2O2濃度，y軸是熒光值，得出一個方程，在看你樣品的熒光值即Y值是多少，對應(yīng)的X值就是。

9.?有的細胞裝載探針后細胞容易漂起來，洗細胞時實驗組會吸走一部分細胞。所以種細胞時細胞量增加一倍，這樣細胞緊密連接，貼壁比較牢，實驗組的熒光值就高了。另外的H2DCFDA很敏感，工作液濃度要低一些，1-2μM就夠啦，濃度太高容易有非特異性染色。這個探針很不穩(wěn)定，一旦氧化了本底熒光值就會升高，最好工作液現(xiàn)用現(xiàn)配。

使用說明

1.?裝載ROS?探針

1.1?原位裝載探針(僅適用于貼壁細胞)

a)?細胞準備：檢測前一天進行細胞鋪板，確保檢測時細胞數(shù)量小于5×10^5/ml。

b)?藥物誘導(dǎo)：去除細胞培養(yǎng)液，加入無血清培養(yǎng)基稀釋的藥物處理，于37℃細胞培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵育，實際誘導(dǎo)時間由藥物特性和細胞類型決定。

c)?（可選）陽性對照：先用無血清培養(yǎng)基等稀釋陽性對照（Rosup, 100 mM）到常用工作濃度100 μM，加入細胞，37℃避光孵育0.5～4 h，以提高活性氧水平，不同細胞類型存在差異。例如：HeLa?細胞需孵育30-60 min，MRC5?人胚胎成纖維細胞則需孵育90 min。

d) ROS?探針準備：探針裝載前按照1:1000?用無血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA，使其終濃度為10 μM。

e) ROS?探針裝載：吸除處理藥物，加入適當體積稀釋好的DCFH-DA?工作液。加入的體積需充分蓋住細胞。例如：6孔板通常不少于1000 μL，對于96?孔板通常不少于100 μL。37℃細胞培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵育30 min。

f)?細胞清洗：用無血清培養(yǎng)液洗滌細胞1～2?次，以充分去除未進入細胞內(nèi)的DCFH-DA。

1.2?收集細胞后裝載探針(適用于貼壁細胞和懸浮細胞)

a)?細胞準備：按照標準方法培養(yǎng)細胞，必須保證檢測用細胞狀態(tài)。按照適當方法，清洗并收集足量的細胞。

b)?藥物誘導(dǎo)：將收集好的細胞懸浮于適量稀釋好的藥物，于37℃細胞培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵育，實際誘導(dǎo)時間由藥物特性和細胞類型決定。

c)?（可選）陽性對照：先用無血清培養(yǎng)基稀釋陽性對照（Rosup, 100 mM）到常用工作濃度100 μM，加入細胞，37℃避光孵育0.5～4 h?以提高活性氧水平，不同細胞類型存在差異。例如：HeLa?細胞需孵育30-60 min，MRC5?人胚胎成纖維細胞則需孵育90min。

d) ROS?探針準備：探針裝載前，按照1:1000?用無血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA，使其終濃度為10 μM。

e)?探針裝載：除去細胞內(nèi)藥物，離心收集細胞，加入稀釋好的探針，使其細胞密度為1×10^6?～?2×10^7。

注意：細胞密度需根據(jù)后續(xù)的檢測體系，檢測方法，以及檢測總量來進行調(diào)整。例如：對于流式分析，單管檢測內(nèi)細胞數(shù)目不少于10^4，也不可多于10^6。

f)?細胞清洗：用無血清細胞培養(yǎng)液洗滌細胞1-2?次，以充分去除未進入細胞內(nèi)的DCFH-DA。

2.?熒光顯微照相操作方法

a)?對貼壁生長細胞或活組織，可直接在熒光顯微鏡下觀察；對懸浮生長細胞，取25-50 μL?細胞懸液滴到一張顯微載玻片上，再蓋上一張蓋玻片。

b)?熒光顯微鏡下，選用FITC?濾光片觀察熒光，去除背景觀察熒光的變化。

3.?流式細胞分析操作方法

a)?對貼壁生長細胞，用胰酶消化制備成單細胞懸液；對懸浮生長細胞，直接收集細胞。用0.5-1 mL PBS?重懸細胞(0.5～1 x 10^5/ml)。

b)?選擇流式細胞儀FL1?或BL1?通道，488nm?激發(fā)，測定530nm?的發(fā)射，細胞應(yīng)可分成兩個亞群：ROS?陰性細胞僅有很低的熒光強度，ROS?陽性細胞有較強的綠色熒光。

4.參數(shù)設(shè)置

使用488nm激發(fā)波長，525nm發(fā)射波長，實時或逐時間點檢測刺激前后熒光的強弱。DCF的熒光光譜和FITC非常相似，可以用FITC的參數(shù)設(shè)置檢測DCF。DCF的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜參考下圖。

使用活性氧檢測試劑盒(Reactive oxygen species assay kit)顯示CHO細胞內(nèi)活性氧熒光。

左圖：CHO細胞用試劑盒配備的活性氧陽性對照處理；右圖：正常CHO細胞。綠色熒光表明細胞活性氧急劇增加，并能顯示其定位。

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