引言

隨著越來越多的生物相關(guān)研究領(lǐng)域的擴(kuò)展，尤其是基因組編輯領(lǐng)域的迅速發(fā)展，現(xiàn)有的分子和細(xì)胞技術(shù)需要得到改進(jìn)，需要更先進(jìn)的轉(zhuǎn)染技術(shù)來限度地發(fā)揮其潛在的應(yīng)用。近年來納米技術(shù)的發(fā)展為細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)提供了新的研發(fā)思路。泛瑞FanRi-Trans是最新一代研發(fā)合成的納米轉(zhuǎn)染試劑，屬于新一代非病毒轉(zhuǎn)染試劑。其利用細(xì)胞對特定尺寸納米粒的胞吞原理，是經(jīng)液相超聲分散、超離等多級工藝制備合成不同粒徑的納米粒子轉(zhuǎn)染試劑。該納米粒子呈球形，具有較大比表面積，有利于負(fù)載各種核酸分子。納米粒子經(jīng)修飾后帶有正電荷，能與各類帶負(fù)電荷的核酸（DNA, siRNA, miRNA等）結(jié)合，與核酸穩(wěn)定結(jié)合后，能有效保護(hù)核酸被環(huán)境中的各類酶降解。由于制備出的納米粒子-核酸復(fù)合物，是納米級別，能高效被細(xì)胞識別并胞吞，進(jìn)入細(xì)胞后，利用納米粒子上的正電荷產(chǎn)生的質(zhì)子海綿效應(yīng)，所負(fù)載的核酸能很容易從溶酶體中釋放出來發(fā)揮功能。納米粒子-核酸復(fù)合物利用仿生原理，能有效降低細(xì)胞毒性，適用于體內(nèi)、體外多種組織和細(xì)胞轉(zhuǎn)染。同時該納米粒子可以與核酸直接混合，不需用其他試劑稀釋后再混合，混合后15分鐘即可加入含血清、抗生素等完全培養(yǎng)基中進(jìn)行轉(zhuǎn)染，操作流程十分簡便。該產(chǎn)品解決了病毒載體的諸多缺點(diǎn)，如病毒毒性、免疫原性、有限的 DNA 裝載量等，并具有高轉(zhuǎn)染效率和低細(xì)胞毒性等特點(diǎn)。適用于將小片段RNA，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染各種細(xì)胞系、原代細(xì)胞等；或?qū)⑿∑?/span>RNA，質(zhì)粒進(jìn)行活體組織內(nèi)轉(zhuǎn)染。與目前常規(guī)應(yīng)用的脂質(zhì)體試劑相比，其轉(zhuǎn)染過程操作更加簡便，轉(zhuǎn)染效率更高，價格低廉。與目前市面上廣泛應(yīng)用的Lipofectamine 3000相比，FanRi-Trans更具成本效益，應(yīng)用更為廣泛。

FanRi-Trans目前開發(fā)出兩款劑型，FanRi-Trans CE 用于各類細(xì)胞轉(zhuǎn)染，FanRi-Trans TI 用于動物體內(nèi)進(jìn)行RNA干擾或蛋白過表達(dá)實(shí)驗(yàn)。轉(zhuǎn)染時只需將轉(zhuǎn)染試劑與待轉(zhuǎn)染的小RNA、質(zhì)粒按比例混勻，孵育15分鐘后即可加入到細(xì)胞培養(yǎng)基中或注射到體內(nèi)組織，操作簡便，極大地簡化工作流程。FanRi-Trans TI可將小片段RNA或質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到動物體內(nèi)多種組織，在動物體內(nèi)進(jìn)行RNA干擾或蛋白過表達(dá)實(shí)驗(yàn)。注射后3天即可取組織進(jìn)行檢測相關(guān)基因或蛋白的表達(dá)情況。FanRi-Trans TI能保護(hù)和濃縮核酸，避免核酸被體液中的核酸酶破壞，能耐受體內(nèi)復(fù)雜的環(huán)境，且毒性低，不會誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)。

材料與方法

l 質(zhì)粒及小RNA設(shè)計(jì)與制備

對于質(zhì)粒制備，需要用無內(nèi)毒素質(zhì)粒抽提試劑盒提純，確保低內(nèi)毒素活性和高質(zhì)量的DNA，質(zhì)粒濃度一般不低于200ng/uL。為觀察轉(zhuǎn)染效率，質(zhì)粒載體上可以攜帶熒光基因，比如綠色熒光蛋白GFP等。

 對于小RNA制備一般由公司合成，加入RNA-free 酶水稀釋至濃度為20μM 即可進(jìn)行轉(zhuǎn)染。為觀察轉(zhuǎn)染效率，小RNA上可以修飾熒光集團(tuán)，比如Cy5.5等。

l 細(xì)胞培養(yǎng)

提前一天將細(xì)胞種植在24孔板，以轉(zhuǎn)染時細(xì)胞密度在70-80％為宜，1天后，待細(xì)胞狀態(tài)良好時進(jìn)行轉(zhuǎn)染（注意：細(xì)胞處于良好的對數(shù)生長期狀態(tài)具有較高的轉(zhuǎn)染效率）。

l FanRi-Trans CE細(xì)胞轉(zhuǎn)染流程（以24孔板為例）

①  在轉(zhuǎn)染前30 min,給待轉(zhuǎn)染細(xì)胞更換新鮮培養(yǎng)基。

②  轉(zhuǎn)染復(fù)合物制備（以24孔板為例）：將2.5 μL（母液濃度20 μM）小片段RNA或 2.5 μg質(zhì)粒直接加入到2.5 μL轉(zhuǎn)染試劑中，充分混勻（可用振蕩器振蕩或用加樣器吹吸混勻），室溫靜置15分鐘。轉(zhuǎn)染復(fù)合物制備完成。

③  將轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入到培養(yǎng)基中，輕柔混勻，將培養(yǎng)板放回培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染24后如細(xì)胞狀態(tài)好可不必更換培養(yǎng)基 

注意：轉(zhuǎn)染過程中可以采用含血清的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，且有助于提升轉(zhuǎn)染效率。

④  對于轉(zhuǎn)染帶熒光的小片段RNA, 轉(zhuǎn)染6小時后即可應(yīng)用流式細(xì)胞儀，熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡檢測轉(zhuǎn)染效率。如果是檢測轉(zhuǎn)染的目的基因mRNA表達(dá)水平，推薦在轉(zhuǎn)染后24-48 h檢測。如果是檢測蛋白表達(dá)水平，推薦在轉(zhuǎn)染后48小時后進(jìn)行檢測。

⑤ 該產(chǎn)品可以同時將多種小片段RNA，多種質(zhì)?；蛐∑?/span>RNA和質(zhì)粒進(jìn)行細(xì)胞共轉(zhuǎn)染。

轉(zhuǎn)染注意事項(xiàng)：

①  轉(zhuǎn)染帶熒光的小片段RNA要注意整個實(shí)驗(yàn)過程中盡量避光。檢測帶熒光的siRNA或miRNA的轉(zhuǎn)染效率時，觀察時間不宜太長，避免熒光淬滅，且由于攜帶的熒光比較弱，轉(zhuǎn)染后分布整個細(xì)胞中，用熒光顯微鏡觀察熒光較弱，建議選用流式細(xì)胞儀檢測其轉(zhuǎn)染效率。

②  如果轉(zhuǎn)染效率較低，在保證細(xì)胞狀態(tài)良好情況下可以擴(kuò)大轉(zhuǎn)染復(fù)合物的量來達(dá)到理想的轉(zhuǎn)染效率。

③  不同細(xì)胞培養(yǎng)容器轉(zhuǎn)染推薦用量見表1所示，可以在此基礎(chǔ)上適當(dāng)調(diào)整小片段RNA、質(zhì)粒與轉(zhuǎn)染試劑的量，以達(dá)到轉(zhuǎn)染效果。

表1 FanRi-Trans CE 轉(zhuǎn)染質(zhì)粒、小RNA產(chǎn)品用量參考

l FanRi-Trans TI動物活體組織轉(zhuǎn)染

FanRi-Trans TI體內(nèi)轉(zhuǎn)染效率高，操作簡單，只需將小片段RNA或質(zhì)粒與轉(zhuǎn)染試劑混勻，孵育15分鐘后即可注射到動物體內(nèi)。該劑型可以轉(zhuǎn)染體內(nèi)多種組織包括肌肉、神經(jīng)組織，皮膚、心、腎、肺、肝、血液等，且可以同時將多種小片段RNA，多種質(zhì)?；蛐∑?/span>RNA和質(zhì)粒進(jìn)行共轉(zhuǎn)染。動物活體組織轉(zhuǎn)染所需注射的試劑量與動物種類、體重、轉(zhuǎn)染組織相關(guān)。實(shí)驗(yàn)前，可根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇合適劑量的轉(zhuǎn)染試劑。我們以小鼠尾靜脈及小鼠腓腸肌注射為例，推薦FanRi-Trans TI的配比濃度（表2）。

表2 FanRi-Trans TI體內(nèi)注射劑量參考表

結(jié)果

1、FanRi-Trans CE細(xì)胞轉(zhuǎn)染結(jié)果示例

2、FanRi-Trans CE神經(jīng)干細(xì)胞轉(zhuǎn)染結(jié)果示例

3、FanRi-Trans CE轉(zhuǎn)染siRNA-FAM結(jié)果示例

4、FanRi-Trans TI動物活體組織轉(zhuǎn)染結(jié)果示例

5、FanRi-Trans與LIPO 3000轉(zhuǎn)染細(xì)胞效果比較，FanRi-Trans轉(zhuǎn)染效果明顯優(yōu)于LIPO 3000

結(jié)論

FanRi-Trans是采用先進(jìn)的納米合成技術(shù)研發(fā)的一款高效轉(zhuǎn)染試劑，具有以下優(yōu)點(diǎn)：

1. 對于難轉(zhuǎn)的細(xì)胞系，原代細(xì)胞具有良好的轉(zhuǎn)染效率。

2. 轉(zhuǎn)染操作過程簡便，只需將轉(zhuǎn)染試劑與小片段RNA或質(zhì)粒按比例直接混勻，孵育15分鐘即可加到含血清的培養(yǎng)基中，且轉(zhuǎn)染后無需換液。

3. 具有生物相容性，生物可降解性，低毒性。

4. 轉(zhuǎn)染過程可兼容血清和抗生素。

5. 適合于RNA, DNA及其共轉(zhuǎn)染。

號

FanRi-Trans CE 005/010/020/050/100/150

FanRi-Trans TI 005/010/020/050/100/150

儲存條件： 2-8°C 儲存