Advance 人多能干細(xì)胞培養(yǎng)基

一、產(chǎn)品基本信息

二、產(chǎn)品簡介

Advance 人多能干細(xì)胞培養(yǎng)基是埃澤思生物科技有限公司（Applied Cell^?）自主研發(fā)的一款營養(yǎng)成分更豐富，適用于大多數(shù)多能細(xì)胞系培養(yǎng)，且適用于 iPS 建系。該培養(yǎng)基適用于 Essential 8 系統(tǒng)和 mTeSR 培養(yǎng)系統(tǒng)，為無滋養(yǎng)層培養(yǎng)、無血清、化學(xué)成分明確?？蓱?yīng)用于干細(xì)胞傳代，內(nèi)含干細(xì)胞保護因子，防止     細(xì)胞的凋亡、分化，對細(xì)胞具有良好的保護作用。GMP 級別生產(chǎn)車間，嚴(yán)格執(zhí)行 cGMP 操作標(biāo)準(zhǔn)，各項指標(biāo)優(yōu)于行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。

三、產(chǎn)品特性

l 適用于 E8 系統(tǒng)和 mTeSR 系統(tǒng)培養(yǎng)的人多能干細(xì)胞

l 成分明確，批間差小

l 無需滋養(yǎng)層細(xì)胞

l 營養(yǎng)更豐富，適用于大多數(shù)細(xì)胞系培養(yǎng)，且適用重編程過程細(xì)胞培養(yǎng)

四、產(chǎn)品內(nèi)容

五、相關(guān)產(chǎn)品

即用型基質(zhì)膠（Applied Cell^?: AC-1001007）

人多能干細(xì)胞消化液（Applied Cell^?: AC-1001008）

ES/iPS 細(xì)胞凍存液（Applied Cell^?: AC-1001012）

六、實驗準(zhǔn)備 Advance 人多能干細(xì)胞培養(yǎng)基配制

1) 2-8℃解凍 Advance 人多能干細(xì)胞-添加劑，融化后上下晃動混勻，按實際用量進行分裝，立即使用或儲存于-20~ -80℃，避免反復(fù)凍融；

2) 按 1:4 的比例將 Advance 人多能干細(xì)胞-添加劑（100mL）加入到 Advance 人多能干細(xì)胞-基礎(chǔ)培養(yǎng)基(400mL)中，混合均勻即成為人多能干細(xì)胞培養(yǎng)基。混勻后的人多能干細(xì)胞培養(yǎng)基可在 2-8℃ 穩(wěn)定儲存 2-3 周，不建議使用配制已超過 3 周的人多能干細(xì)胞條件培養(yǎng)基。

3) 實驗試劑平衡：人多能干細(xì)胞培養(yǎng)基實驗前放置室溫避光平衡；PBS，消化液等 37℃加熱。注意：培養(yǎng)基中含有因子，不要 37℃水浴加熱。

七、操作方法(以下步驟皆應(yīng)在無菌條件下操作) hPSC 細(xì)胞復(fù)蘇

1. 實驗操作步驟：

1.1. 基質(zhì)膠包被培養(yǎng)板：取出 6 孔板/12 孔板，每孔內(nèi)加入 1 mL/0.5 mL 即用型基質(zhì)膠

（AC-1001007），輕輕晃動 6 孔板/12 孔板使基質(zhì)膠完全覆蓋皿底，置于 37℃培養(yǎng)箱中孵育1h~2h，實驗前拿出并置于超凈工作臺/生物安全柜中室溫下平衡 20min。如果暫時不用，可用Parafilm 封口后 2-8℃ 儲存，并于 1 周內(nèi)使用。

注意：①一支凍存的干細(xì)胞的數(shù)量在 1×10⁶cells/mL 左右，對應(yīng) 6 孔板 1 孔；②即用型基質(zhì)膠對溫度敏感，即用即拿，用完后立即放回 4℃冰箱保存，且勿用手直接觸碰基質(zhì)膠液面所及的瓶身， 影響基質(zhì)膠質(zhì)量。

1.2. 先將 2~3mL 的干細(xì)胞培養(yǎng)基加入 15mL 離心管中備用。

1.3. 解凍：將從液氮中取出的凍存管快速浸入 37℃溫水中，快速搖動，使其在 1~2min 內(nèi)快速解凍； 注意：細(xì)胞從液氮中拿出的速度要快，盡量減少其暴露在室溫中的時間。

1.4. 離心：凍存管中的凍存液解凍后，將其逐滴加入含有干細(xì)胞培養(yǎng)基的 15mL 離心管中，將 15mL 離心管置于低速離心機中配比平衡后，1200rpm 離心 3min；

1.5. 重懸：離心后棄上清加 1mL Advance 人多能干細(xì)胞培養(yǎng)基對干細(xì)胞沉淀進行吹吸混勻，吹吸3~5 次左右。

1.6. 接種：吹吸均勻后，將已經(jīng)平衡好的即用型基質(zhì)膠棄掉，將吹打均勻的干細(xì)胞懸液加入到已經(jīng)包    被好的 6 孔板中，并補全每孔 2mL 培養(yǎng)體系。

1.7. 培養(yǎng)：接種后的 6 孔板可以置于倒置相差顯微鏡下觀察接種的干細(xì)胞密度以及細(xì)胞團塊大小，呈4 個細(xì)胞以上的團塊較合格，水平十字輕輕晃動 6 孔板/12 孔板使細(xì)胞均勻分布。并置于 37℃， 5% CO₂ 的恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，第 2 天觀察細(xì)胞貼壁情況；

1.8. 換液：從復(fù)蘇的時間開始每 24h 換液一次。

注意：因培養(yǎng)基中活性成分只足夠維持一天，所以每 24h 應(yīng)及時更換新鮮培養(yǎng)基。

八、hPSC 細(xì)胞傳代

2. 實驗具體操作步驟：

2.1. 清洗：吸掉原有培養(yǎng)基，貼壁緩慢加入 1 mL PBS 緩沖液并輕輕晃動，然后沿培養(yǎng)皿邊緣吸去 PBS 緩沖液；

2.2. 消化：在 6 孔板中加入 2mL/孔人多能干細(xì)胞消化液（AC-1001008）使之覆蓋皿底，并置于 37℃ 培養(yǎng)箱中 2~5 min；

注意：消化時間依據(jù)干細(xì)胞生長密度，消化時間略有不同，根據(jù)經(jīng)驗一般建議時間 2-5min。消化過程中可以拿到倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若在顯微鏡下觀察到大部分克隆邊緣以及克     隆內(nèi)部細(xì)胞間出現(xiàn)間隙，即可吸掉消化液終止消化。

2.3. 吹打：吸掉消化液后，加入 2mL Advance 人多能干細(xì)胞培養(yǎng)基，用移液槍扇形吹打培養(yǎng)皿底， 輕柔吹打 3~5 次，使皿底干細(xì)胞集落脫落，并將其并轉(zhuǎn)移到 15mL 離心管中；

注意：吹吸皿底細(xì)胞的力度要輕柔，吹打脫落和吹吸混勻的次數(shù)在 3~5 次為宜，盡量避免形成單細(xì)胞。如有少量細(xì)胞無法從皿底脫落，屬于正?，F(xiàn)象。如有大量細(xì)胞無法從皿底脫落，需延長     消化時間。

2.4. 離心：1200rpm 離心 3min；

2.5. 接種：棄上清，用干細(xì)胞培養(yǎng)基吹打細(xì)胞 5-10 次，吸掉包被培養(yǎng)板中的基質(zhì)膠，并將細(xì)胞懸液加入到培養(yǎng)板中，且補全每孔 2mL 的培養(yǎng)體系。

注意：吹打細(xì)胞要溫柔，并且吹打次數(shù)不要超過 10 次，并且

2.6. 換液：從傳代的時間開始每 24h 換液一次。

注意：因培養(yǎng)基中活性成分只足夠維持一天，所以每 24h 應(yīng)及時更換新鮮培養(yǎng)基。

九、hPSC 細(xì)胞凍存

3. 實驗具體操作步驟：

3.1. 清洗：同 2.1；

3.2. 消化：同 2.2；

3.3. 吹打：同 2.3；

3.4. 離心：同 2.4；

3.5. 重懸：離心后棄上清，加入 2 mL ES/iPS 細(xì)胞凍存液（AC- 1001012）對干細(xì)胞沉淀進行吹吸混勻，吹吸 3~5 次后，將其加入到凍存管中；

注意：凍存液即用即拿，及時放回 4℃冰箱。

3.6. 記錄：在凍存管上標(biāo)記凍存細(xì)胞種類、時間、操作者及細(xì)胞批次。

3.7. -80℃冰箱凍存：凍存管置于-80℃冰箱過夜。

注意：凍存管放置于-80℃冰箱時，要將凍存管直立放置，切忌凍存管斜放或橫放。

3.8. 液氮凍存：24 小時后將-80℃冰箱中的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至液氮中長期凍存。

十、細(xì)胞形態(tài)圖

細(xì)胞形態(tài)圖 細(xì)胞熒光圖

十一、質(zhì)量控制