人多能干細(xì)胞培養(yǎng)基
一、產(chǎn)品基本信息
產(chǎn)品名稱 | Applied Cell ?人多能干細(xì)胞培養(yǎng)基 |
規(guī) 格 | 基礎(chǔ)培養(yǎng)基 490mL，添加劑 10mL |
保存條件 | 基礎(chǔ)培養(yǎng)基 2-8℃，添加劑-20～-80℃；混合后 2-8℃ |
使用范圍 | 人多能干細(xì)胞擴(kuò)增、傳代 |
保質(zhì)期 | 12 個月 |
二、產(chǎn)品簡介
人多能干細(xì)胞培養(yǎng)基是埃澤思生物科技有限公司（Applied Cell?）自主研發(fā)的一款無外源動物成分、化學(xué)成分明確且適用于無滋養(yǎng)層培養(yǎng)的人多能干細(xì)胞培養(yǎng)基。該產(chǎn)品適用于 Essential 8 系統(tǒng)培養(yǎng)的干細(xì)胞，可應(yīng)用于干細(xì)胞傳代，內(nèi)含干細(xì)胞保護(hù)因子，防止細(xì)胞的凋亡、分化，對細(xì)胞具有良好的保 護(hù)作用。本產(chǎn)品生產(chǎn)過程遵循 ISO9001 體系,并符合 GMP 指導(dǎo)原則。
三、產(chǎn)品特性
l 無需滋養(yǎng)層細(xì)胞。
l 成分明確，批間差小。
l 適用于 Essential 8 系統(tǒng)培養(yǎng)的人多能干細(xì)胞。
l 無外源動物成分，大大降低各類病毒、霉菌和支原體等的污染風(fēng)險(xiǎn)。
四、產(chǎn)品內(nèi)容
組分 | 規(guī)格 | 數(shù)量 | 運(yùn)輸 |
hPSC Medium Basal Medium 人多能干細(xì)胞-基礎(chǔ)培養(yǎng)基 | 490mL | 1 瓶 | 冰袋 |
hPSC Medium Supplement 人多能干細(xì)胞-添加劑 | 10mL | 1 支 | 干冰 |
五、相關(guān)產(chǎn)品
即用型基質(zhì)膠（Applied Cell?: AC-1001007）
人多能干細(xì)胞消化液（Applied Cell?: AC-1001008）
干細(xì)胞凍存液（治療級）（Applied Cell?:AC-1001006）
六、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備
人多能干細(xì)胞培養(yǎng)基配制
1） 2-8℃解凍 hPSC Medium Supplement，融化后上下晃動混勻，按實(shí)際用量進(jìn)行分裝，立即使用或儲存于-20~ -80℃，避免反復(fù)凍融；
2） 按 1:50 的 比 例 將 hPSC Medium Supplement（10mL） 加 入 到 hPSC Medium Basal Medium(500mL)中，混合均勻即成為人多能干細(xì)胞培養(yǎng)基?；靹蚝蟮娜硕嗄芨杉?xì)胞培養(yǎng)基可在2-8℃ 穩(wěn)定儲存 2-3 周，不建議使用配制已超過 3 周的人多能干細(xì)胞培養(yǎng)基。
3） 實(shí)驗(yàn)試劑平衡：人多能干細(xì)胞培養(yǎng)基實(shí)驗(yàn)前放置室溫避光平衡；PBS，消化液等 37℃加熱。注意：培養(yǎng)基中含有因子，不要 37℃水浴加熱。
七、操作方法(以下步驟皆應(yīng)在無菌條件下操作) hPSC 細(xì)胞復(fù)蘇
1. 實(shí)驗(yàn)操作步驟：
1.1 基質(zhì)膠包被培養(yǎng)板：取出 6 孔板/12 孔板，每孔內(nèi)加入 1 mL/0.5 mL 即用型基質(zhì)膠（AC-1001007），輕輕晃動 6 孔板/12 孔板使基質(zhì)膠完全覆蓋皿底，置于 37℃培養(yǎng)箱中孵育 1h~2h，實(shí)驗(yàn)前拿出并置于超凈工作臺/生物安全柜中室溫下平衡 20min。如果暫時(shí)不用，可用 Parafilm 封口后 2-8℃ 儲存，并于 1 周內(nèi)使用。
注意：①一支凍存的干細(xì)胞的數(shù)量在 1×106cells/mL 左右，對應(yīng) 6 孔板 1 孔；②即用型基質(zhì)膠對溫度敏感，即用即拿，用完后立即放回 4℃冰箱保存，且勿用手直接觸碰基質(zhì)膠液面所及的瓶身， 影響基質(zhì)膠質(zhì)量。
1.2 先將 2~3mL 的干細(xì)胞培養(yǎng)基加入 15mL 離心管中備用。
1.3 解凍：將從液氮中取出的凍存管快速浸入 37℃溫水中，快速搖動，使其在 1~2min 內(nèi)快速解凍； 注意：細(xì)胞從液氮中拿出的速度要快，盡量減少其暴露在室溫中的時(shí)間。
1.4 離心：凍存管中的凍存液解凍后，將其逐滴加入含有干細(xì)胞培養(yǎng)基的 15mL 離心管中，將 15mL 離心管置于低速離心機(jī)中配比平衡后，1000rpm 離心 3min；
1.5 重懸：離心后棄上清加 1mL 人多能干細(xì)胞培養(yǎng)基對干細(xì)胞沉淀進(jìn)行吹吸混勻，吹吸 3~5 次左右。
1.6 接種：吹吸均勻后，將已經(jīng)平衡好的即用型基質(zhì)膠棄掉，將吹打均勻的干細(xì)胞懸液加入到已經(jīng)包被 好的 6 孔板中，并補(bǔ)全每孔 2mL 培養(yǎng)體系。
1.7 培養(yǎng)：接種后的 6 孔板可以置于倒置相差顯微鏡下觀察接種的干細(xì)胞密度以及細(xì)胞團(tuán)塊大小，呈 4 個細(xì)胞以上的團(tuán)塊較合格，水平十字輕輕晃動 6 孔板/12 孔板使細(xì)胞均勻分布。并置于 37℃，5% CO2 的恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，第 2 天觀察細(xì)胞貼壁情況；
1.8 換液：從復(fù)蘇的時(shí)間開始每 24h 換液一次。
注意：因培養(yǎng)基中活性成分只足夠維持一天，所以每 24h 應(yīng)及時(shí)更換新鮮培養(yǎng)基。
八、hPSC 細(xì)胞傳代
2. 實(shí)驗(yàn)具體操作步驟：
2.1 清洗：吸掉原有培養(yǎng)基，貼壁緩慢加入 1 mL PBS 緩沖液并輕輕晃動，然后沿培養(yǎng)皿邊緣吸去 PBS 緩沖液；
2.2 消化：在 6 孔板中加入 2mL/孔人多能干細(xì)胞消化液（AC-1001008）使之覆蓋皿底，并置于 37℃ 培養(yǎng)箱中 2~5 min；
注意：消化時(shí)間依據(jù)干細(xì)胞生長密度，消化時(shí)間略有不同，根據(jù)經(jīng)驗(yàn)一般建議時(shí)間 2-5min。消化過程中可以拿到倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若在顯微鏡下觀察到大部分克隆邊緣以及克隆內(nèi)部細(xì) 胞間出現(xiàn)間隙，即可吸掉消化液終止消化。
2.3 吹打：吸掉消化液后，加入 2mL 人多能干細(xì)胞培養(yǎng)基，用移液槍扇形吹打培養(yǎng)皿底，輕柔吹打 3~5 次，使皿底干細(xì)胞集落脫落，并將其并轉(zhuǎn)移到 15mL 離心管中；
注意：吹吸皿底細(xì)胞的力度要輕柔，吹打脫落和吹吸混勻的次數(shù)在 3~5 次為宜，盡量避免形成單細(xì)胞。如有少量細(xì)胞無法從皿底脫落，屬于正?，F(xiàn)象。如有大量細(xì)胞無法從皿底脫落，需延長消化時(shí)間。
2.4 離心：1000rpm 離心 3min；
2.5 接種：棄上清，用干細(xì)胞培養(yǎng)基吹打細(xì)胞 5-10 次，吸掉包被培養(yǎng)板中的基質(zhì)膠，并將細(xì)胞懸液加入到培養(yǎng)板中，且補(bǔ)全每孔 2mL 的培養(yǎng)體系。
注意：吹打細(xì)胞要溫柔，并且吹打次數(shù)不要超過 10 次，并且
2.6 換液：從傳代的時(shí)間開始每 24h 換液一次。
注意：因培養(yǎng)基中活性成分只足夠維持一天，所以每 24h 應(yīng)及時(shí)更換新鮮培養(yǎng)基。
九、hPSC 細(xì)胞凍存
3. 實(shí)驗(yàn)具體操作步驟：
3.1 清洗：同 2.1； 3.2 消化：同 2.2； 3.3 吹打：同 2.3；
3.4 離心：同 2.4；
3.5 重懸：離心后棄上清，加入 2 mL 無血清干細(xì)胞凍存液（AC- 1001006）對干細(xì)胞沉淀進(jìn)行吹吸混勻，吹吸 3~5 次后，將其加入到凍存管中；
注意：凍存液即用即拿，及時(shí)放回 4℃冰箱。
3.6 記錄：在凍存管上標(biāo)記凍存細(xì)胞種類、時(shí)間、操作者及細(xì)胞批次。
3.7 -80℃冰箱凍存：凍存管置于-80℃冰箱過夜。
注意：凍存管放置于-80℃冰箱時(shí)，要將凍存管直立放置，切忌凍存管斜放或橫放。
3.8 液氮凍存：24 小時(shí)后將-80℃冰箱中的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至液氮中長期凍存。
十、細(xì)胞形態(tài)圖
十一、質(zhì)量控制
檢驗(yàn)項(xiàng)目 Test Catagories | 參考數(shù)據(jù) Reference Data | 結(jié)果 The results |
外觀 Physical APPearance | 橙紅色液體 Orange-red liquid | 符合規(guī)定 Conform to the provisions |
澄清度 Clarity | 澄清 Clear | 符合規(guī)定 Conform to the provisions |
pH 值 Ph value | 6.9-7.3 | 符合規(guī)定 Conform to the provisions |
滲透壓 Osmolality | 270-340 （mosm/KgH2O） | 符合規(guī)定 Conform to the provisions |
無菌 Sterility | 無菌 Sterility | 符合規(guī)定 Conform to the provisions |
支原體Mycoplasma | 0.11um 過濾，支原體試驗(yàn)為陰性The mycoplasma test was negative after 0.11um filtration | 符 合 規(guī) 定 Conform to the provisions |
細(xì)胞生長試驗(yàn)Cell growth test | 細(xì)胞呈克隆狀，克隆邊緣光滑The cells are clonal, with smooth edges | 符 合 規(guī) 定 Conform to the provisions |
關(guān)鍵字： 人多能干細(xì)胞培養(yǎng)基; Essential 8 系統(tǒng)培養(yǎng);埃澤思干細(xì)胞培養(yǎng)基;
埃澤思生物總部位于上海，公司取名Applied Cell(應(yīng)用細(xì)胞)，是一家致力于為細(xì)胞治aize 療、再生埃澤思生物總部位于上海，公司取名AppliedCell(應(yīng)用細(xì)胞)，是一家致力于為細(xì)胞治療、再生醫(yī)學(xué)提供核心原料，以及研發(fā)服務(wù)（CRO ）和生物藥委托開發(fā)生產(chǎn)服務(wù)（CDMO）的生物科技公司。目前公司產(chǎn)品已經(jīng)涵蓋干細(xì)胞、免疫細(xì)胞治療全流程試劑原料。其中核心產(chǎn)品已經(jīng)完成美國FDADMF備案以及國家藥品評審中心（CDE）藥物原輔料備案，是國內(nèi)資質(zhì)最為齊全的細(xì)胞治療原料供應(yīng)商之一。目前，公司已與國內(nèi)6家細(xì)胞治療企業(yè)進(jìn)行細(xì)胞治療一類新藥聯(lián)合申報(bào)，一項(xiàng)日本一類新藥聯(lián)合申報(bào)。