NADPH-細(xì)胞色素C還原酶（NCR）活性測定試劑盒說明書
微量法100管/96樣
注 意：正式測定之前選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。
NADPH-細(xì)胞色素C還原酶（NCR）活性測定試劑盒測定意義：
細(xì)胞色素P450酶是一組主要存在于肝臟的同工酶，在外源物質(zhì)代謝中具有重要作用，尤其是藥物和毒物的代謝。NCR作為P450酶系的重要一員，催化氧化型P450還原再生。
測定原理：
NCR催化NADPH還原氧化型細(xì)胞色素C，還原型細(xì)胞色素C在550nm處有特征吸收峰；通過測定550nm吸光度的增加速率，來計算NCR活性。
自備儀器和用品：
普通離心機(jī)，超速離心機(jī)、可調(diào)式移液槍、紫外分光光度計/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板和蒸餾水。
試劑組成和配置：
試劑一：粉劑×2瓶，4℃保存。臨用前根據(jù)用量每瓶加100mL蒸餾水充分溶解。
試劑二：液體×1瓶，4℃保存。
試劑三：粉劑×1管，-20℃保存。臨用前配制，加1.04 mL蒸餾水充分溶解，4℃保存。
試劑四：粉劑×1管，4℃保存。臨用前配制，加1100 μL蒸餾水充分溶解，4℃保存。
粗酶液提取：
1、除去細(xì)胞核和線粒體等：稱約0.5g組織，加入4℃預(yù)冷的1 mL試劑一，冰上充分研磨，10 000g 4℃離心30min，取上清液，轉(zhuǎn)移到超速離心管中。
2、粗制微粒體：4℃，100 000g，離心60min，棄上清液。
3、除血紅蛋白等雜質(zhì)：向步驟2的沉淀中加1 mL試劑一，蓋緊后充分震蕩溶解，100 000g離心30min，棄上清液。
4、最終微粒體：向步驟3的沉淀中加試劑二0.5 mL，蓋緊后充分震蕩溶解，4℃保存待測。
NADPH-細(xì)胞色素C還原酶測定操作：
1. 分光光度計/酶標(biāo)儀預(yù)熱30 min，調(diào)節(jié)波長到550 nm，蒸餾水調(diào)零。
2. 試劑二在37℃水浴中預(yù)熱30min。
3. 空白管：取微量石英比色皿/96孔板，依次加入10μL蒸餾水、180μL試劑二、10μL試劑三和10μL試劑四，迅速混勻后于550nm處測定2min內(nèi)吸光值變化，第10s和第130s吸光值。△A空白管=A2-A1。
4. 測定管：取微量石英比色皿/96孔板，依次加入10μL提取液、180μL試劑二、10μL試劑三和10μL試劑四，迅速混勻后于550nm處測定2min內(nèi)吸光值變化，第10s和第130s吸光值。△A測定管=A4-A3。
注意：空白管只需做一次。
NCR活性計算公式公式：
a.使用微量石英比色皿測定的計算公式如下
（1）按蛋白濃度計算
活性單位定義：37℃中，每毫克蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1μmol還原型細(xì)胞色素C為1個酶活單位。
NCR ((nmol/min /mg prot)= (△A測定管-△A空白管)÷(ε×d)×V反總÷（Cpr×V樣）÷T
= 550×(△A測定管-△A空白管)÷Cpr
（2）按樣本質(zhì)量計算
活性單位定義：37℃中，每克組織每分鐘催化產(chǎn)生1μmol還原型細(xì)胞色素C為1個酶活單位。
NCR ((nmol/min/g 鮮重)= (△A測定管-△A空白管)÷(ε×d)×V反總÷(V樣÷V樣總×W)÷T
=275×(△A測定管-△A空白管)÷W
ε：還原型細(xì)胞色素C摩爾消光系數(shù)，19100L/mol/cm=0.0191L/μmol/cm；d：比色皿光徑（cm），1cm；V反總：反應(yīng)體系總體積（L），210μL=2.1×10-4L；Cpr：上清液蛋白質(zhì)濃度（mg/mL），需要另外測定；V樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積（mL），10μL=0.01mL；V樣總：提取液體積，0.5 mL；T：反應(yīng)時間（min），2min 。
b.使用96孔板測定的計算公式如下
（1）按蛋白濃度計算
活性單位定義：37℃中，每毫克蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1μmol還原型細(xì)胞色素C為1個酶活單位。
NCR ((nmol/min/mg prot)= (△A測定管-△A空白管)÷(ε×d)×V反總÷（Cpr×V樣）÷T
= 1100×(△A測定管-△A空白管)÷Cpr
（2）按樣本質(zhì)量計算
活性單位定義：37℃中，每克組織每分鐘催化產(chǎn)生1μmol還原型細(xì)胞色素c為1個酶活單位。
NCR ((nmol/min/g 鮮重) = (△A測定管-△A空白管)÷(ε×d)×V反總÷(V樣÷V樣總×W)÷T
= 550×(△A測定管-△A空白管)÷W
ε：還原型細(xì)胞色素C摩爾消光系數(shù)，19100L/mol/cm=0.0191L/μmol/cm；d：96孔板光徑（cm），0.5cm；V反總：反應(yīng)體系總體積（L），210μL=2.1×10-4L；Cpr：上清液蛋白質(zhì)濃度（mg/mL），需要另外測定；V樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積（mL），10μL=0.01mL；V樣總：提取液體積，0.5mL；T：反應(yīng)時間（min），2min 。
NADPH-細(xì)胞色素C還原酶（NCR）活性測定試劑盒注意事項：
試劑三、試劑四臨用前配制，配好未使用完的4℃可保存兩天。
關(guān)鍵字： NADPH-細(xì)胞色素C還原酶（NCR）活;NADPH-細(xì)胞色素C還原酶（NCR）活;
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