NADPH-細胞色素C還原酶（ NCR）試劑盒說明書

          分光光度法  50管/48樣

注    意：正式測定之前選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。

測定意義：

細胞色素P450酶是一組主要存在于肝臟的同工酶，在外源物質(zhì)代謝中具有重要作用，尤其是藥物和毒物的代謝。NCR作為P450酶系的重要一員，催化氧化型P450還原再生。

測定原理：

NCR催化NADPH還原氧化型細胞色素c生成還原型細胞色素c，還原型細胞色素c在550nm處有特征吸收峰；通過測定550nm吸光度的增加速率，來計算NCR活性。

自備儀器和用品：

可見分光光度計、普通離心機，超速離心機、可調(diào)式移液槍、1mL玻璃比色皿和蒸餾水。

NADPH-細胞色素C還原酶（ NCR）試劑盒組成和配制：

試劑一：粉劑×1瓶，4℃保存。臨用前加100mL蒸餾水充分溶解。

試劑二：液體×1瓶，4℃保存。

試劑三：粉劑×1瓶，-20℃保存。臨用前配制，加2.6 mL蒸餾水充分溶解，4℃保存。

試劑四：粉劑×1瓶，4℃保存。臨用前配制，加550 μL蒸餾水充分溶解，4℃保存。

粗酶液提取：

1、除去細胞核和線粒體等：稱約0.5g組織，加入4℃預(yù)冷的1 mL試劑一，冰上充分研磨，10 000g 4℃離心30min，取上清液，轉(zhuǎn)移到超速離心管中。

2、粗制微粒體：4℃，100 000g，離心60min，棄上清液。

3、除血紅蛋白等雜質(zhì)：向步驟2的沉淀中加1 mL試劑一，蓋緊后充分震蕩溶解，100 000g離心30min，棄上清液。

4、最終微粒體：向步驟3的沉淀中加試劑二0.5 mL，蓋緊后充分震蕩溶解，4℃保存待測。

測定操作：

1. 分光光度計預(yù)熱30 min，調(diào)節(jié)波長到550 nm，蒸餾水調(diào)零。

2. 試劑二在37℃水浴中預(yù)熱30min。

3. 空白管：取1mL玻璃比色皿，依次加入50μL蒸餾水、900μL試劑二、50μL試劑三和10μL試劑四，迅速混勻后于550nm處測定2min內(nèi)吸光值變化，第10 s和第130 s吸光值分別記為A1和A2，△A空白管=A2-A1。

4. 測定管：取1mL玻璃比色皿，依次加入50μL粗酶液、900μL試劑二、50μL試劑三和10μL試劑四，迅速混勻后于550nm處測定2min內(nèi)吸光值變化，第10 s和第130 s吸光值分別記為A3和A4，△A測定管=A4-A3。

注意：空白管只需要做一次。

計算公式：

(1).按照蛋白濃度計算

活性單位定義：37℃中，每毫克蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1nmol還原型細胞色素C為1個酶活單位。

NCR酶活性 (nmol/min/mg prot)= (△A測定管-△A空白管)÷ε÷d×V反總÷（Cpr×V樣）÷T

= 529×(△A測定管-△A空白管)÷Cpr

(2)按照樣本質(zhì)量計算

活性單位定義：37℃中，每克樣品每分鐘催化產(chǎn)生1nmol還原型細胞色素C為1個酶活單位。

NCR酶活性(nmol/min/g 鮮重)= (△A測定管-△A空白管)÷ε÷d×V反總÷（W×V樣÷V樣總）÷ T

= 265×(△A測定管-△A空白管)÷W

ε：還原型細胞色素C摩爾消光系數(shù)，19100L/mol/cm=0.0191L/μmol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V反總：反應(yīng)體系總體積，1010μL=0.00101L；Cpr：上清液蛋白質(zhì)濃度，mg/mL，需要另外測定；V樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積，50μL=0.05mL；V樣總：加入提取液體積，0.5mL；W：樣本質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時間，2min。

NADPH-細胞色素C還原酶（ NCR）試劑盒注意事項：

試劑三、試劑四臨用前配制，配好未使用完的4℃可保存兩天。