糖化酶(Glucoamylase)試劑盒說明書

分光光度法50管/24樣

注   意 ：正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定。

糖化酶(Glucoamylase)試劑盒測定意義：

糖化酶，即葡萄糖淀粉酶（EC3.2.1.3），又稱γ-淀粉酶，是一種外切型糖苷酶，它從淀粉的非還原性末端水解α-1,4糖苷鍵和α-1,6糖苷鍵，將淀粉完全水解為葡萄糖，因此廣泛的應用于酒精、白酒、抗生素、氨基酸、有機酸，甘油，淀粉糖等工業(yè)中，是我國重要的工業(yè)酶制劑之一。

測定原理：

糖化酶水解可溶性淀粉生成葡萄糖，與3,5-二硝基水楊酸生成紅棕色化合物，在540nm處有光吸收，在一定范圍內反應液顏色深淺與葡萄糖的量成正比，可測定計算得糖化酶的活力。

自備實驗用品及儀器：

天平、低溫離心機、可見分光光度計、1 mL玻璃比色皿、恒溫水浴鍋。

試劑組成和配制：

提取液：液體50mL×1瓶，4℃保存。

試劑一：液體25mL×1瓶，4℃保存。

試劑二：液體25mL×1瓶，4℃避光保存。

糖化酶(Glucoamylase)試劑盒酶液提取：

1. 組織：按照質量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g，加入1mL提取液）加入提取液，冰浴勻漿后于4℃，10000g離心10min，取上清置于冰上待測。

2. 細胞：按照細胞數量（10⁴個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細胞加入1mL提取液），冰浴超聲波破碎細胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時間3min）；然后4℃，10000g離心10min，取上清置于冰上待測。

3. 培養(yǎng)液或其它液體：直接檢測。

測定操作：

酶活性計算公式：

標準曲線：y = 0.2164x - 0.0182，R² = 0.9992 

1. 按照蛋白含量計算

酶活性定義：在40℃，pH4.6條件下，每毫克蛋白每分鐘分解可溶性淀粉產生1mg葡萄糖所需的酶量為一個酶活力單位。

糖化酶活性（U/mg prot）=（△A+0.0182）÷ 0.2164×V反總÷（V樣×Cpr）÷T

                        = 2.54×（△A+0.0182）÷ Cpr

2. 按照樣本質量計算

酶活性定義：在40℃，pH4.6條件下，每克組織每分鐘分解可溶性淀粉產生1mg葡萄糖所需的酶量為一個酶活力單位。

糖化酶活性（U/g 鮮重）=（△A+0.0182）÷ 0.2164×V反總÷（W×V樣÷V樣總）÷T

= 2.54×（△A+0.0182）÷ W

3.按照液體體積計算

酶活性定義：在40℃，pH4.6條件下，每毫升培養(yǎng)液每分鐘分解可溶性淀粉產生1mg葡萄糖所需的酶量為一個酶活力單位。

糖化酶活性（U/mL）=（△A+0.0182）÷ 0.2164×V反總÷V樣÷T

                  = 2.54×（△A+0.0182）

4. 按照細胞數量計算

酶活性定義：在40℃，pH4.6條件下，每10⁴個細胞每分鐘分解可溶性淀粉產生1mg葡萄糖所需的酶量為一個酶活力單位。

糖化酶活性（U/10⁴cell）=（△A+0.0182）÷ 0.2164×V反總÷（V樣×細胞數量（萬個）÷V樣總）÷T

                      = 2.54×（△A+0.0182）÷ 細胞數量（萬個）

V反總：反應總體積，0.55mL，V樣：反應體系中加入樣本體積，0.05mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；W：樣本質量，g；T：反應時間，30min

注意事項：

1. 滅活樣本的制備建議將樣本放在沸水浴中煮沸10min，以將酶徹底滅活。

2. 測定之前進行預實驗，若吸光值較高，請將樣品用提取液進行適當的稀釋再測定，并在計算公式中乘以稀釋倍數。