乙酸激酶（acetate kinase，ACK）試劑盒說明書

                                     分光光度法50管/48樣

注   意 ：正式測定前務(wù)必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定

乙酸激酶（acetate kinase，ACK）試劑盒測定意義：                           

ACK主要存在于微生物中，催化乙酸和ATP生成乙酰磷酸和ADP，是細菌碳代謝和能量代謝的關(guān)鍵酶，尤其是在古細菌甲烷合成代謝中起著中樞作用。

測定原理：

（1）ACK催化乙酸鈉和ATP生成乙酰磷酸和ADP，（2）丙酮酸激酶催化ADP和PEP生成ATP和丙酮酸，（3）乳酸脫氫酶催化丙酮酸和NADH生成乳酸和NAD⁺，（4）在340nm下測定NADH氧化生成NAD⁺速率，即可反映ACK活性。

需自備的儀器和用品：

紫外分光光度計、臺式離心機、水浴鍋、可調(diào)式移液器、1mL石英比色皿、研缽、冰和蒸餾水

試劑組成和配制：

提取液：液體50mL×1瓶，4℃保存；

試劑一：液體60mL×1瓶，4℃保存；

試劑二：粉劑×2瓶，-20℃保存；

試劑三：液體1.2mL×1支，4℃保存；

樣本的前處理：

1、細菌或培養(yǎng)細胞：先收集細菌或細胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細菌或細胞數(shù)量（10⁴個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細菌或細胞加入1mL提取液），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復30次）；15000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

2、組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進行冰浴勻漿。15000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

乙酸激酶（acetate kinase，ACK）試劑盒測定步驟：

1、 分光光度計或酶標儀預熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至340nm，蒸餾水調(diào)零。

2、 樣本測定

（1）工作液的配置：臨用前取試劑二一瓶，加入25mL試劑一和500μL試劑三，充分混合溶解，置于37℃（哺乳動物）或25℃（其它物種）水浴5min；現(xiàn)配現(xiàn)用；

（2）在1mL石英比色皿中加入100μL樣本和900μL工作液，混勻，立即記錄340nm處20s時的吸光值A1和 3min20s后的吸光值A2，計算ΔA=A1-A2。

ACK活性計算：

（1）按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位。

ACK（nmol/min /mg prot）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V樣×Cpr) ÷T=536×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計算：

單位的定義：每g組織每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位。

ACK（nmol/min /g 鮮重）= [ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W× V樣÷V樣總) ÷T=536×ΔA÷W

（3）按細菌或細胞密度計算：

單位的定義：每1萬個細菌或細胞每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位。

ACK（nmol/min /10⁴ cell）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T=1.072×ΔA

V反總：反應體系總體積，1×10^-3 L；ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.1 mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應時間，3 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細菌或細胞總數(shù)，500萬。