焦磷酸：果糖-6-磷酸-1-磷酸轉(zhuǎn)移酶（Pyrophosphate: fructose-6 – phosphate-1-phosphoric acid transferase，PFP）試劑盒說明書

                                            
                                                 分光光度法50管/48樣

注   意 ：正式測定之前選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。

焦磷酸：果糖-6-磷酸-1-磷酸轉(zhuǎn)移酶試劑盒測定意義：

焦磷酸：果糖-6-磷酸-1-磷酸轉(zhuǎn)移酶（PFP，EC2.7.1.90）是一種胞質(zhì)酶，廣泛存在于植物組織中，催化果糖-6-磷酸與果糖-1,6-二磷酸之間的可逆轉(zhuǎn)化，在光合作用碳代謝中起重要作用。

測定原理：

PFP催化6-磷酸果糖轉(zhuǎn)化為1,6-二磷酸果糖，它在醛縮酶和磷酸丙糖異構(gòu)酶的作用下轉(zhuǎn)變?yōu)?span style="font-size: 18px; font-family: Calibri;">3-磷酸甘油醛，再由3-磷酸甘油醛脫氫酶和NADH催化生成3-磷酸甘油酸、NAD和磷酸，340nm處的吸光度變化反映了PFP的活性的高低。

自備實驗用品及儀器：

天平、低溫離心機、研缽、紫外分光光度計、1 mL石英比色皿。

試劑組成和配制：  

提取液：液體50mL×1瓶，4℃保存。

試劑一：液體30mL×1瓶，4℃避光保存。

試劑二：粉劑×1 瓶，-20℃避光保存。臨用前加5mL蒸餾水充分溶解；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

試劑三：粉劑×1瓶，-20℃避光保存。臨用前加5 mL蒸餾水充分溶解；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

試劑四：液體0.5mL×1瓶，4℃避光保存。

試劑五：液體0.5mL×1瓶，4℃避光保存。

試劑六：液體5mL×1瓶，4℃避光保存。

酶液提取：

1. 組織：按照質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g，加入1mL提取液）加入提取液，冰浴勻漿后于4℃，10000g離心10min，取上清置冰上待測。

2. 細胞：按照細胞數(shù)量（10⁴個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細胞加入1mL提取液），冰浴超聲波破碎細胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時間3min）；然后4℃，10000g離心10min，取上清置冰上待測。

3. 液體：直接檢測。

測定操作：

1. 分光光度計預(yù)熱30min，調(diào)節(jié)波長至340nm，蒸餾水調(diào)零。

2. 取1mL石英比色皿，依次加入580μL試劑一，100μL試劑二，100μL試劑三，10μL試劑四，10μL試劑五，100μL試劑六，100μL粗酶液，充分混勻，記錄340nm處10s的吸光值A1和310s的吸光值A2，

    △A=A1-A2

焦磷酸：果糖-6-磷酸-1-磷酸轉(zhuǎn)移酶試劑盒計算公式：

（1）按照樣本蛋白濃度計算

酶活單位定義：每毫克組織蛋白每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位。

PFP（nmol/min/mg prot）=ΔA÷（ε×d）×V反總÷(V樣×Cpr) ÷T=321.54×ΔA÷Cpr

（2）按照樣本質(zhì)量計算

酶活單位定義：每克組織每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位。

PFP（nmol/min /g 鮮重）=ΔA÷（ε×d）×V反總÷(W ×V樣÷V樣總) ÷T=321.54×ΔA÷W

（3）按照細胞數(shù)量計算

酶活單位定義：每10⁴個細胞每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位。

PFP（nmol/min /10⁴ cell）= ΔA÷（ε×d）×V反總÷(V樣×細胞數(shù)量÷V樣總) ÷T

=321.54×ΔA÷細胞數(shù)量

（4）按照液體體積計算

酶活單位定義：每毫升液體每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位。

PFP（nmol/min /mL）=ΔA÷（ε×d）×V反總÷V樣÷T=321.54×ΔA

V反總：反應(yīng)體系總體積，1mL；ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.1mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；T：反應(yīng)時間，5 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g