構建關節(jié)炎（CIA）大鼠模型

CIA是用牛II型膠原免疫誘導構建的

• 選擇8周齡雄性Sprague-Dawley大鼠

• CIA建立前，采用1%戊巴比妥鈉(40mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠

  。

• II型膠原在0.05 mol/L乙酸中溶解至4mg /mL。

• 采用電動均質(zhì)器，將等量的不完全弗氏佐劑乳化制備膠原蛋白

  。

• 取0.1 mL乳狀液分別于第0天和第7天皮下接種CIA大鼠

  。

• No.2

  成纖維樣滑膜細胞（FLSs）的分離和鑒定

  成纖維樣滑膜細胞（FLSs）的分離

  從CIA大鼠滑膜標本中分離FLSs細胞：

  實驗前采用頸椎脫位安樂死。用膠原酶消化法獲得FLSs細胞，用含1%氨芐西林和鏈霉素的PBS在冰上沖洗滑膜組織5次，然后將滑膜組織切片成1 mm3厚的薄片，置于含有0.2% II型膠原酶的培養(yǎng)皿中，并放置37℃培養(yǎng)箱。

  整個過程中，每60min收集上清，1200 rpm離心5min，收集細胞顆粒，用培養(yǎng)基懸浮后，完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，后經(jīng)過200目不銹鋼過濾器過濾，以1*105/cm2的密度接種在細胞培養(yǎng)瓶中，并在5% CO2、37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。當達到90%融合時，傳代細胞，第2代細胞用于后續(xù)實驗。

   

  成纖維樣滑膜細胞（FLSs）的鑒定

  用Vimentin（波形蛋白）抗體對分離得到的FLSS細胞進行鑒定，將第2代FLSS細胞接種在細胞培養(yǎng)板中的載玻片上。

  培養(yǎng)3天后，除去上清液，用4％多聚甲醛固定FLSS 20 min、TritonX滲透20 min、3％H2O2處理15 min，再用5％BSA孵育20 min后，將切片與抗-Vimentin抗體置濕盒中4℃孵育過夜。

  第二天用PBS 3 min×5次洗去一抗，用濾紙擦去標本外的PBS，滴加生物素化二抗工作液，室溫置濕盒中孵育20 min，用PBS 5min×3次洗去二抗，用濾紙擦去標本外的PBS，DAB顯色劑顯色，自來水充分沖洗后進行蘇木素復染，脫水，透明，中性樹膠封片。