正常細(xì)胞中的磷脂酰絲氨酸(PhosphatidylserinePS)位于細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)在細(xì)胞發(fā)生凋亡時PS會從細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜表面即暴露在細(xì)胞的外環(huán)境中。Annexin-V是一種分子量在35~36KD的Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白與PS有極高高親和力可以與之發(fā)生特異性結(jié)合將Annexin-V進(jìn)行熒光素(FITC)標(biāo)記成Annexin-V. FITC探針用該探針標(biāo)記待檢測細(xì)胞利用流式儀通過檢測FITC信號即可反應(yīng)帶警車細(xì)胞的凋亡情況。

當(dāng)然對于現(xiàn)有的凋亡檢測試劑并沒有滿足于整體調(diào)亡情況的反映一般的試劑會結(jié)合碘化丙啶(propidineiodide.PI)進(jìn)行更細(xì)層面的檢測。PI是一種核酸染料它不能透過完整的細(xì)胞膜但在調(diào)亡中晚期的細(xì)胞和壞死細(xì)胞細(xì)胞膜一般會發(fā)生破裂此時PI能夠細(xì)胞膜進(jìn)入到細(xì)胞核內(nèi)嵌入到DNA中使細(xì)胞核釋放紅色熒光。

在操作過程中不論是分離組織細(xì)胞或是收集培養(yǎng)中的細(xì)胞需盡量避免污染一般收集1*106的細(xì)胞制備成1mL的細(xì)胞懸液按照凋亡檢測試劑盒說明書進(jìn)行操作即可但一定要注意整個過程需要輕柔操作以免造成細(xì)胞是寫損傷而影響檢測結(jié)果。探針孵育完成后需在1小時以內(nèi)完成檢測另外上機檢測時記得配上不做任何標(biāo)記的陰性對照管哦。

對于實驗結(jié)果首先我們需要在細(xì)胞自身光散射特性方面進(jìn)行評判。調(diào)亡細(xì)胞形態(tài)上的改變影響它們的光散射特性。在流式細(xì)胞儀上前向散射光與細(xì)胞的大小有關(guān)而側(cè)向散射光反映的是光在細(xì)胞內(nèi)的折射作用與細(xì)胞內(nèi)的顆粒多少有關(guān)。在細(xì)胞凋亡時細(xì)胞固縮體積變小故前向散射光降低這一特性往往被認(rèn)為是凋亡細(xì)胞的特點之一。此外細(xì)胞調(diào)亡時由于染色體降解核破裂形成細(xì)胞內(nèi)顆粒往往增多故凋亡細(xì)胞側(cè)向散射光常增加。細(xì)胞壞死時由于細(xì)胞腫脹其前向散射光增大側(cè)向散射光在細(xì)胞壞死時也增大因此可根據(jù)前向散射光和側(cè)向散射光區(qū)別調(diào)廣細(xì)胞和壞死細(xì)胞。但需要注意的是根據(jù)前散射光和側(cè)向散射光判斷凋廣細(xì)胞的可靠性受被檢測細(xì)胞形態(tài)上的均一性和核胞漿比率影響很大。因此我們必須要進(jìn)行調(diào)亡因子的直接反映。

前面我們提到凋亡中晚期的細(xì)胞和壞死細(xì)胞由于其細(xì)胞膜損傷Pl能夠穿透細(xì)胞膜而嵌入DNA中是細(xì)胞核產(chǎn)生紅色熒光。而細(xì)胞膜保持完好的早期凋亡細(xì)胞對于細(xì)胞活性鑒定的染料PI有抗染性則不會有紅色熒光產(chǎn)生正常活細(xì)胞與之相似。在雙變顯流式細(xì)胞儀的散點圖上所呈現(xiàn)的結(jié)果即為左上象限顯示機械損傷細(xì)胞為(FITC-/PI+)左下象限顯示活細(xì)胞為(FITC-/PI-)右上象限是非活細(xì)胞即壞死細(xì)胞或晚期凋亡細(xì)胞為(FITC+/PI+)而右下象限為早期調(diào)亡細(xì)胞呈現(xiàn)(FITC+/PI-)。

最后提醒一下想要做流式凋亡檢測結(jié)果統(tǒng)計的科研汪們由于用流式檢測凋亡時PI受時間的影響很大,因為標(biāo)記了PI后會加大細(xì)胞毒性隨著時間延長會導(dǎo)致PI的染色增加特別是檢測早期凋亡時,如果時間延長除了會導(dǎo)致在流式細(xì)胞儀上的細(xì)胞分群差距加大外誤差會明顯加大。根據(jù)以前做流式凋亡時的經(jīng)驗建議每組實驗一次可以先做三個復(fù)孔上機前5分鐘加Pl在半小時內(nèi)檢測完畢。這時可以先分析下三個復(fù)孔的差異。等待摸索的實驗條件成熟后每組實驗一次可以做6~8個復(fù)孔然后做統(tǒng)計學(xué)分析。嚴(yán)格說來當(dāng)做出統(tǒng)計學(xué)差異時這樣的實驗還要重復(fù)三次。但是因檢測凋亡時，受細(xì)胞狀態(tài)PI染色時間，流式檢測時間,以及每次實驗時的誤差等的影響外很難保證能夠完全重復(fù)出上次的結(jié)果甚至即使在保證了實驗條件幾乎相同的情況下每次重復(fù)的差異也會中現(xiàn)加大的情況。這時可以話當(dāng)重復(fù)2~3次盡量使差異減小。