慢病毒包裝試劑盒
一、產品簡介。
本產品包括慢病毒包裝質粒(Lenti-Mix)、陽性對照質粒(lenti-GFP)、質粒 DNA 轉染試劑(Omifection)和病毒感染增強試劑(polybrene),其中包裝質粒能夠與已經構建的慢病毒骨架質粒聯合,生產高滴度的慢病毒。
二、運輸和存儲條件。
1. 本產品低溫運輸,各組份依據保存條件分開保存,自購買之日起,有效期為 12 個月。
2. Omifection 與 Polybrene 嚴禁凍存。
三、特點與優(yōu)勢。
1. 本試劑盒中的包裝質粒能夠與多家公司提供的慢病毒骨架質粒配合,生產高滴度的慢病毒。
2. 本試劑盒中的轉染試劑 Oimifection,轉染效率高,可以保證生產高滴度的慢病毒。
四、自備試劑與耗材。
1. OPTI-MEM 培養(yǎng)液 (Gibco)
2. 293T 細胞,是 293TN 細胞(System Biosciences),病毒生產量大。
五、 使用說明
1. 慢病毒包裝。
1) 細胞培養(yǎng)。293T 細胞傳代接種于細胞培養(yǎng)皿(Φ 100 mm),置于 37℃,5% CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng),24 h 后細胞密度達到 60%~80%。(細胞密度不宜過大,否則影響轉染效率)
2) 轉染。向 Lenti-Mix 中加入 1 mL OPTI-MEM 培養(yǎng)液,再加入 9 μg 慢病毒骨架質粒(目的蛋白過表達或 RNAi 質粒,或一管 GFP 對照質粒),混勻,加入 54 μL 轉染試劑 Omifection,混合 10 次,室溫靜置 30 min,滴加入細胞培養(yǎng)液中,輕輕搖勻。
3) 換液。轉染 6-12 h,更換成新鮮的細胞培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng)。
4) 慢病毒收集。轉染 48 h,收集批含有慢病毒的細胞培養(yǎng)上清(暫時置于 4 ℃冰箱中保存),5) 293T 細胞中再加入 10 ml 新鮮的細胞培養(yǎng)液,24-48 h 后,收集第二批含有慢病毒的細胞培養(yǎng)上清(第二批細胞培養(yǎng)上清中的慢病毒滴度高于批)。
6) 離心。含有慢病毒的細胞培養(yǎng)上清轉入離心機,3 000 rpm,4 ℃離心 5 min,棄沉淀,上清轉入新的無菌離心管,即為含有慢病毒的細胞培養(yǎng)上清。
7) 含有慢病毒的細胞培養(yǎng)上清可在 4 ℃保存 1 個月,長期保存應置于-80 ℃,但凍融一次,病毒感染效果降低 30-50%。
2. 慢病毒感染
1) 目的細胞培養(yǎng)。目的細胞傳代后接種到細胞培養(yǎng)皿(Φ 100 mm)中,24 h 后細胞密度達到30%-50%。
2) 慢病毒感染。棄培養(yǎng)液,加入 5 ml 新鮮培養(yǎng)液和 5 mL 含有慢病毒的細胞培養(yǎng)上清液,再加入病毒感染增強試劑(polybrene,1: 500-1:2000 稀釋),輕搖,混勻。
3) 換液。病毒感染 12-24 h 后更換成新鮮的培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng),若無細胞毒性,可以不換液。
4) 檢測。慢病毒感染 72 h,熒光顯微鏡下觀察 GFP 表達情況,或檢測目的基因表達水平。
六、注意事項。
1. 請使用高純度的慢病毒骨架質粒用于轉染,質粒的 OD260/OD280 比值在 1.8~2.0 之間為宜。
2. 293T 細胞生長狀態(tài)對于病毒包裝至關重要,因此需要保證良好的細胞生長狀態(tài),一般使用代數較低(20 代以內)的 293T(N)細胞進行慢病毒包裝。
3. 293T 細胞的密度應該控制在 60-80%之間,密度過低,病毒產量較低,密度過高,則轉染效率降低,也會導致慢病毒滴度的降低。
4. 本試劑盒提供的轉染試劑(Omifection)與病毒感染增強試劑(polybrene)嚴禁凍存。
5. 為了增強慢病毒感染效果,可以使用本公司的慢病毒感染增強試劑盒(Cat:OmL-04),其感染增強效果比對 Polybrene 可以提高 4-8 倍。
關鍵字: 慢病毒包裝試劑盒;Omifection;polybrene;
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