脂肪肝，也稱為脂肪性肝病，是一種以細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)異常積累為特征的病理過(guò)程。雖然單純的脂肪肝可能與肝功能的顯著損害無(wú)關(guān)，但過(guò)多的脂肪積累可能導(dǎo)致肝硬化甚至肝衰竭。非酒精性脂肪肝的分子機(jī)制尚不清楚，關(guān)于脂質(zhì)積累后導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷進(jìn)展的途徑（s）的信息也很少。確定肝毒性是藥物發(fā)現(xiàn)過(guò)程中的一個(gè)重要組成部分，其中包括脂肪肝作為評(píng)估的關(guān)鍵參數(shù)之一。Cayman的脂肪肝比色測(cè)定試劑盒提供了一個(gè)方便的工具，用于評(píng)估藥物候選物的脂肪肝風(fēng)險(xiǎn)。在這個(gè)測(cè)定中，使用油紅O染色肝細(xì)胞中的中性脂質(zhì)。然后，在染料從脂滴中提取后，使用板讀數(shù)器對(duì)脂質(zhì)積累進(jìn)行定量。試劑盒中包含氯喹作為陽(yáng)性對(duì)照。
需要但未提供的：請(qǐng)下載試劑盒手冊(cè)，以驗(yàn)證是否需要超純水（Milli-Q或等效物）或該測(cè)定的其他任何組分。
警告：本品不適用于人類或獸醫(yī)用途。
艾美捷Cayman的脂肪變性比色分析試劑盒（#10012643-1），用于評(píng)估使用油紅O染色肝細(xì)胞中性脂質(zhì)的候選藥物的乳糖病風(fēng)險(xiǎn)。從脂滴中提取液后，可以使用平板讀數(shù)器定量脂質(zhì)積聚。試劑盒中包含氯喹作為陽(yáng)性對(duì)照，用于篩選誘導(dǎo)肝細(xì)胞脂肪變性的候選藥物。
脂肪變性比色分析試劑盒測(cè)定方案：
板配置
在板孔的使用上沒(méi)有特定的模式?？梢允褂?2孔、24孔或96孔板。一個(gè)典型的實(shí)驗(yàn)板將包括沒(méi)有細(xì)胞的孔和用實(shí)驗(yàn)化合物或載體處理的細(xì)胞孔。我們建議每個(gè)處理進(jìn)行三次重復(fù)。我們建議您在提供的模板表上記錄每個(gè)孔的內(nèi)容。
細(xì)胞處理：
以下方案是為96孔板設(shè)計(jì)的。對(duì)于其他板型，應(yīng)相應(yīng)調(diào)整每個(gè)孔施加的培養(yǎng)基/溶液體積。
1. 在96孔板中每孔播種10?個(gè)細(xì)胞。培養(yǎng)細(xì)胞過(guò)夜。
2. 第二天，用實(shí)驗(yàn)化合物或載體處理細(xì)胞72小時(shí)，或根據(jù)您的典型實(shí)驗(yàn)方案使用的時(shí)間。氯喹，一種已知能誘導(dǎo)脂肪肝的化合物，作為試劑盒中的陽(yáng)性對(duì)照。推薦的濃度是25μM。在這個(gè)濃度下，經(jīng)過(guò)72小時(shí)的處理后，應(yīng)該可以觀察到脂滴積累的顯著誘導(dǎo)。
3. 結(jié)束實(shí)驗(yàn)，并使用下面描述的脂滴染色程序檢查實(shí)驗(yàn)化合物對(duì)脂肪肝的影響。
細(xì)胞內(nèi)脂滴的分布
下圖展示了使用本試劑盒在肝細(xì)胞中觀察到的脂質(zhì)積累的典型染色示例。您的結(jié)果可能會(huì)根據(jù)所接種的細(xì)胞數(shù)量和脂質(zhì)積累的程度而有所不同。
圖：氯喹對(duì)HepG2細(xì)胞脂滴積累的影響。HepG2細(xì)胞以每孔10?個(gè)細(xì)胞的密度在96孔板中接種，并在37°C孵化器中過(guò)夜培養(yǎng)。第二天，細(xì)胞用載體或不同劑量的氯喹處理三天。A組：用載體處理的HepG2細(xì)胞。細(xì)胞中有一些脂滴，表現(xiàn)為紅色點(diǎn)狀。B組：用25μM氯喹處理的HepG2細(xì)胞顯示出脂滴的顯著積累，這通過(guò)油紅O染色觀察到的大量紅色點(diǎn)狀明顯可見(jiàn)。
脂肪變性比色分析試劑盒文獻(xiàn)參考：
1.Burt,AD.Steatosis and steatohepatitis.Current Diagnostic Pathology 7,141-147(2001).
2.Donohue,T.M,r.Alcohol-induced steatosisin liver cells.World JGastroenterol.13(37),4974-4978(2007).
3.Adams,LA,Angulo,P,and Lindor,KD.Nonalcoholic fatty liver disease.CMAJ 172(7),899-905(2005).
4.Non-clinical guideline on drug-induced hepatotoxicity.(2006).
https://www.amyjet.com/products/10012643-1.shtml