近年來(lái)，生物學(xué)領(lǐng)域襲來(lái)一股“外泌體”研究熱潮。從細(xì)胞的排泄“廢物”到全球?qū)W者研究的“珍寶”，完成最強(qiáng)逆襲，一躍成為當(dāng)下最炙熱的關(guān)鍵詞。隨處可見的以外泌體為關(guān)鍵詞的高分文章和相關(guān)產(chǎn)品，覆蓋各大領(lǐng)域，同時(shí)具有非常不錯(cuò)的發(fā)展前景，得到國(guó)家各類科研基金以及市場(chǎng)資本的支持。
“外泌體”——最新動(dòng)態(tài)
“外泌體”提取的方法
作為新興研究領(lǐng)域，外泌體研究的技術(shù)方法從最初的不完善，正在走向標(biāo)準(zhǔn)化。國(guó)際細(xì)胞外囊泡學(xué)會(huì)（ISEV）分別在2014年和2018年發(fā)表了EVs的研究方法和質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)。但EVs的分離和純化是EVs相關(guān)基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用的瓶頸問題之一，國(guó)內(nèi)外學(xué)者也在嘗試不同分離與富集方法。不同研究目的對(duì)EVs的純度要求不同，也就面臨不同方法的選擇，下面就幾種常用的EVs分離與富集方法進(jìn)行詳細(xì)介紹。
超速離心法
超速離心法（Ultracentrifugation，UC）可以通過(guò)顆粒大小和密度兩個(gè)不同的維度，單獨(dú)或組合使用差速離心或密度梯度離心的方法來(lái)分離和富集EVs。根據(jù)全世界范圍內(nèi)的ISEV調(diào)查，差速超速離心法是最廣泛使用的EVs分離純化方法，被視為EVs提取的“金標(biāo)準(zhǔn)”。盡管可以通過(guò)差速或密度梯度離心來(lái)減少雜質(zhì)污染，但工作量較大，需要專門離心設(shè)備等，在未來(lái)外泌體的診斷和治療領(lǐng)域中不會(huì)作為首選的分離方法。
超濾法
超濾法（Ultrafiltration，UF）是一種相對(duì)快速和直接的技術(shù)。超濾特別適用于濃縮已通過(guò)其它方法分離的EVs，也可以用作主要的EVs分離/濃縮技術(shù)。超濾法使用的膜通常由纖維素、聚砜等材質(zhì)制成，截留分子量為10-1000 kD。而超濾的一種高級(jí)形式就是切向流過(guò)濾（TFF），區(qū)別于傳統(tǒng)的死端過(guò)濾。TFF是指液體流動(dòng)方向與過(guò)濾方向垂直的過(guò)濾形式，切向流不斷清洗沖刷膜表面，防止堆積，保持膜表面的清潔和持續(xù)工作?；赥FF的過(guò)濾原理和EVs的顆粒分布，切向流超濾（TFU）是目前快速分離EVs的主要方法之一。但TFU過(guò)程中膜容易堵塞，從而造成EVs的損失，該方法更適合從大體積樣本中富集EVs。
圖1 a）死端過(guò)濾；b）切向流過(guò)濾
尺寸排阻色譜法
尺寸排阻色譜法（Size-exclusion chromatography，SEC）是一種將溶液中的分子按照尺寸大小或者在某些情況下按照其分子量大小進(jìn)行分離的色譜方法。SEC已經(jīng)用于多種生物樣本中EVs的分離制備，可單獨(dú)使用或與其它分離方法搭配使用。研究表明，用SEC進(jìn)行EVs分離，并與基于聚乙二醇（PEG）的EVs富集方法相結(jié)合，具有很好的重復(fù)性。目前市場(chǎng)上基于該原理的純化管柱參差不齊，也給廣大客戶帶來(lái)不同的選擇和不同的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
圖2 尺寸排阻色譜法原理示意圖
沉淀法
沉淀技術(shù)在半個(gè)世紀(jì)前就應(yīng)用于富集和提純病毒顆粒，而EVs和病毒顆粒有相近的生物理化特性，根據(jù)溶解度將EVs與其它化合物分離。最常用的親水多聚物沉淀法是PEG沉淀法，PEG親水性強(qiáng)，有較廣范圍的分子量，優(yōu)良的適應(yīng)性和富集功能使其成為目前商品化EVs富集試劑開發(fā)的熱點(diǎn)。
免疫親和分離法
EVs的膜表面存在大量的標(biāo)志物，利用免疫學(xué)中的抗原抗體作用及受體和配體之間的特異性反應(yīng)，可將EVs有效地分離。目前基于免疫親和性原理的EVs富集方法主要有免疫磁珠法和微流控技術(shù)。其中免疫磁珠法主要利用EVs膜上常見標(biāo)志物（例如CD9、CD63、CD81等）以及其它腫瘤相關(guān)標(biāo)志物等來(lái)特異性捕獲與富集。微流控技術(shù)已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了對(duì)EVs的選擇性分離純化，基于EVs的物理和生物化學(xué)性質(zhì)的微尺度分離。與其他方法相比，基于免疫親和原理捕獲的EVs純度更高，利于自動(dòng)化應(yīng)用。
“組合”的方法成為趨勢(shì)
荷蘭學(xué)者通過(guò)收集近兩年共計(jì)700篇論文中描述的所有892種不同EVs分離方法，包括單一和組合的分離方法，分別對(duì)不同來(lái)源樣本進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。文章結(jié)果顯示：約60%為組合的方法分離EVs，其中細(xì)胞上清和血清或血漿都存在6種以上的EVs組合分離方法。另外組合的方法在EVs產(chǎn)量和純度方面整體上優(yōu)于單一方法。該文分析，無(wú)論起始的樣本的類型如何，組合方法分離EVs都顯示了明顯的優(yōu)勢(shì)。但不同研究目的也會(huì)催生研究人員選擇不同的分離方法，已有報(bào)道稱SEC與一種離心的方法相結(jié)合可以有效地從血清或血漿的樣本中去除脂蛋白等雜質(zhì)。且該文作者建議將SEC包括在EVs分離方法中，可提高EVs的純度，同時(shí)會(huì)提高產(chǎn)量。
圖3 不同生物樣本單一和組合分離方法統(tǒng)計(jì)（左圖）；不同分離方法獲得EVs的產(chǎn)量和純度統(tǒng)計(jì)（右圖）
備注：CCS：細(xì)胞培養(yǎng)上清液，LSC：低速離心法，PK：蛋白酶K處理，TEI：總外泌體提取試劑盒，PEX：外泌體純化試劑盒， EQ：Exoquick沉淀法，IBMF：免疫微流控技術(shù)，EP：Exoprep沉淀法，EXE：exoEASY外泌體提取試劑盒。
每一年都有很多EVs相關(guān)的研究報(bào)道，包括基礎(chǔ)功能研究、臨床診斷或疾病治療等，但沒有對(duì)EVs分離方法進(jìn)行評(píng)估，不同分離方法可能會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果不可重復(fù)或EVs質(zhì)量差等?？傊?，沒有單一的EVs分離方法適合所有EVs的研究目的，組合的EVs分離方法逐漸成為一種趨勢(shì)。正確捕獲高質(zhì)量的EVs，提高實(shí)驗(yàn)研究的準(zhǔn)確性和可靠性。
參考文獻(xiàn)
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Stam J, Bartel S, Bischoff R, et al. Isolation of extracellular vesicles with combined enrichment methods. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 2021, 1169: 122604.