免疫組化（Immunohistochemistry, IHC）是一種利用抗原與抗體特異性結(jié)合反應(yīng)來(lái)檢測(cè)和定位組織和細(xì)胞中的某些化學(xué)物質(zhì)的技術(shù)。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中涉及眾多變量，實(shí)驗(yàn)者常常會(huì)遇到各種各樣的問(wèn)題，影響到實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。今天康妮將對(duì)IHC實(shí)驗(yàn)中常見(jiàn)的問(wèn)題進(jìn)行總結(jié)，并提供相應(yīng)的解決策略，以幫助大家優(yōu)化實(shí)驗(yàn)流程，提高實(shí)驗(yàn)成功率！
結(jié)果陰性？
● 抗原丟失：組織處理不當(dāng)，如過(guò)度固定、脫水或熱處理，可以破壞抗原表位，導(dǎo)致抗體無(wú)法識(shí)別。確保使用適合特定抗原的固定和處理方法。
● 抗體問(wèn)題：使用了無(wú)效、低親和力或非特異性抗體。選擇經(jīng)過(guò)充分驗(yàn)證、具有高特異性和親和力的抗體至關(guān)重要。
● 抗原修復(fù)不足：某些抗原需要特定的抗原修復(fù)步驟才能暴露其表位。缺乏或不適當(dāng)?shù)目乖迯?fù)可能導(dǎo)致抗體無(wú)法結(jié)合。換修復(fù)液或加強(qiáng)修復(fù)，優(yōu)化抗原修復(fù)條件。
● 檢測(cè)系統(tǒng)故障：包括酶標(biāo)記物、底物或顯色劑的失效。確保所有試劑在使用前都是有效的，并按照制造商的指南操作。
● 樣本問(wèn)題：樣本可能不含目標(biāo)抗原，或者抗原表達(dá)水平極低，不足以被檢測(cè)到。使用已知表達(dá)目標(biāo)抗原的陽(yáng)性對(duì)照進(jìn)行比較。
● 實(shí)驗(yàn)操作錯(cuò)誤：包括樣本污染、不充分的洗滌步驟、抗體濃度過(guò)低、血清封閉時(shí)間過(guò)長(zhǎng)、DAB孵育時(shí)間過(guò)短、細(xì)胞通透不全抗體未能充分進(jìn)入胞內(nèi)參與反應(yīng)等。
● 信號(hào)檢測(cè)閾值設(shè)置過(guò)高：在定量或半定量分析中，信號(hào)檢測(cè)閾值設(shè)置過(guò)高可能使真實(shí)的低水平表達(dá)被誤判為陰性。根據(jù)樣本和實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮侠碚{(diào)整檢測(cè)閾值。
非特異性染色（著色一片黃/背景過(guò)深）？
● 抗體交叉反應(yīng)：抗體可能與樣本中的多個(gè)抗原或非特異性結(jié)構(gòu)結(jié)合，導(dǎo)致非特異性染色。選擇高特異性的抗體，進(jìn)行預(yù)吸收或使用競(jìng)爭(zhēng)抑制實(shí)驗(yàn)可以減少這一問(wèn)題。
● 抗體濃度過(guò)高：過(guò)量的抗體增加了非特異性結(jié)合的機(jī)會(huì)。優(yōu)化抗體濃度至最佳范圍，通常需要通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)來(lái)確定。
● 樣本處理不當(dāng)：過(guò)度固定、脫水或樣本處理過(guò)程中使用的溶劑可能暴露出額外的結(jié)合位點(diǎn)，促進(jìn)非特異性結(jié)合。優(yōu)化樣本處理步驟，使用溫和的固定劑，并避免過(guò)度處理。
● 洗滌不充分：不充分的洗滌步驟無(wú)法有效去除未結(jié)合的抗體或標(biāo)記物，導(dǎo)致非特異性染色。增加洗滌次數(shù)或延長(zhǎng)洗滌時(shí)間可以改善這一問(wèn)題。
● 檢測(cè)系統(tǒng)敏感度過(guò)高：過(guò)于敏感的檢測(cè)系統(tǒng)可能會(huì)放大非特異性信號(hào)。調(diào)整檢測(cè)系統(tǒng)或信號(hào)放大步驟的敏感度，以減少非特異性染色。
● 內(nèi)源性酶活性：在使用酶標(biāo)記抗體的檢測(cè)系統(tǒng)中，內(nèi)源性酶（如過(guò)氧化物酶）的活性可能引起非特異性染色。使用內(nèi)源性酶抑制劑或進(jìn)行酶失活步驟可以減少這一影響。
● 樣本背景復(fù)雜：高背景樣本可能含有多種潛在的結(jié)合位點(diǎn)，增加非特異性染色的可能性。使用封閉步驟（如血清或蛋白封閉液）可以減少背景染色。
假陽(yáng)性？
● 一抗?jié)舛燃耙豢故欠袷?，抗體有一個(gè)合適的濃度范圍且必須在有效期內(nèi)使用，過(guò)期的抗體或者不著色，或者背景著色，形成假陽(yáng)性；
● 試劑未充分覆蓋組織，組織邊緣的試劑易干濃度較組織中間高致深染；
● 抗體孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，由于室溫的影響夏季孵育時(shí)間稍短，冬季孵育時(shí)間稍長(zhǎng)；
● 操作過(guò)程中組織變干，造成組織邊緣收縮或損壞形成偽影，產(chǎn)生假陽(yáng)性；
● DAB顯色時(shí)間太長(zhǎng)，DAB宜現(xiàn)配現(xiàn)用，配制時(shí)間最好在30min以?xún)?nèi)；
● 由于胞漿里含有較多的蛋白質(zhì)，因此間質(zhì)和胞漿中出現(xiàn)很多非特異性的染色，如內(nèi)源性酶血紅蛋白、肌紅蛋白等造成的著色，可以通過(guò)血清封閉解決；
● 乳腺癌組織中的脂肪細(xì)胞、淋巴細(xì)胞也會(huì)產(chǎn)生非特異性的染色；
● 非特異性抗體吸附常見(jiàn)于壞死組織中，使壞死組織呈較高的背景染色，在免疫組化中應(yīng)避免選擇壞死組織較多的蠟塊；
● PBS 沖洗不充分，殘留抗體結(jié)果增強(qiáng)著色；
弱陽(yáng)性？
● 固定方式不當(dāng)或固定時(shí)溫度過(guò)高，影響到抗原的數(shù)量和質(zhì)量；
● 不適當(dāng)?shù)目乖迯?fù)方式，抗原決定簇暴露不足；
● 抗體的稀釋度是否過(guò)高或者孵育的溫度/時(shí)間不足；
● 孵育抗體前切片上遺留了過(guò)多的沖洗液；
● 孵育時(shí)切片未放置水平，導(dǎo)致抗體孵育不均勻。
染色不均勻？
● 樣本制備不一致：切片厚度不均或樣本固定條件的差異，導(dǎo)致染色劑在樣本上的分布不均勻。
● 抗體分布不均：抗體溶液在樣本上的覆蓋不均勻，或在孵育過(guò)程中未能充分滲透到樣本的所有區(qū)域。
● 抗原修復(fù)不充分：抗原修復(fù)條件（如溫度、時(shí)間）不一致，導(dǎo)致某些區(qū)域的抗原表位未充分暴露。
● 洗滌步驟不徹底：殘留的未結(jié)合抗體或標(biāo)記物可能在某些區(qū)域積聚，導(dǎo)致染色過(guò)深。
● 顯色劑應(yīng)用不均：顯色劑在樣本上的分布不均，或顯色反應(yīng)時(shí)間的不一致。
● 樣本內(nèi)部結(jié)構(gòu)差異：樣本內(nèi)部結(jié)構(gòu)的差異（如細(xì)胞密度、組織類(lèi)型）可能導(dǎo)致染色劑在不同區(qū)域的反應(yīng)性不同。
AntibodySystem
AntibodySystem Laboratories SAS于2019年創(chuàng)立于法國(guó)斯特拉斯堡,專(zhuān)注于生命科學(xué)研究領(lǐng)域蛋白及抗體試劑研發(fā)生產(chǎn)。致力于為全球生命科學(xué)基礎(chǔ)研究者提供高質(zhì)量的蛋白，抗體產(chǎn)品，產(chǎn)品類(lèi)別囊括傳統(tǒng)多抗，經(jīng)典內(nèi)參抗體，標(biāo)簽抗體，高活性蛋白，invivo功能性抗體，低背景流式抗體，高特異性納米抗體，特色小分子抗體，高質(zhì)量磷酸化抗體，DNA/RNA抗體,PEG抗體等十余個(gè)系列;目前AntibodySystem旗下產(chǎn)品線涵蓋500余種病毒與超級(jí)細(xì)菌，寄生蟲(chóng)，腫瘤，老年癡呆，帕金森，變態(tài)與過(guò)敏反應(yīng)，免疫抑制與免疫激活等多個(gè)領(lǐng)域。
佰樂(lè)博生物
武漢佰樂(lè)博生物（Biolab Reagents）由五位畢業(yè)于華中科技大學(xué)，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，武漢大學(xué)等知名高校，且具有二十年工作經(jīng)驗(yàn)的生命科學(xué)領(lǐng)域研究者創(chuàng)立于2021年，憑借豐富的產(chǎn)品開(kāi)發(fā)經(jīng)驗(yàn)，利用全球技術(shù)平臺(tái)，引進(jìn)和整合全球高品質(zhì)的蛋白、抗體和試劑盒產(chǎn)品。目前，佰樂(lè)博生物作為法國(guó)AntibodySystem和ProteoGenix在亞洲總代理，提供近30,000種生命科學(xué)試劑，核心產(chǎn)品涵蓋蛋白、抗體和試劑盒，旨在為科研工作者提供專(zhuān)業(yè)、全面、可靠的試劑支持，推動(dòng)生命科學(xué)研究的深入發(fā)展。