點評 | 蔣華良（中國科學院院士院士，中科院上海藥物研究所）、徐華強（中科院上海藥物研究所）、劉志杰（上?？萍即髮W）
C型G蛋白偶聯(lián)受體（GPCR）是GPCR的一個亞家族，其成員主要包括鈣敏感受體CaSR、代謝型谷氨酸受體mGluR、代謝型γ-氨基丁酸受體GABAB和味覺受體等。不同于其他亞家族GPCR主要通過單體就能產(chǎn)生生理功能，C型GPCR是明確通過受體形成同源或異源二聚體形式而發(fā)揮生理作用。它們保守的捕蠅草結構域（VFT）能結合L氨基酸或者其衍生物，從而使受體發(fā)生構象變化，形成緊密的二聚體激活態(tài)構象。隨著冷凍電鏡技術方法的飛速發(fā)展，C型GPCR的結構研究取得了重要進展，其中mGluR5 （Nature 2019）和GABAB (Nature 2020, Cell Research 2020)的全長結構最近相繼得到解析。
鈣敏感受體CaSR作為C型GPCR的成員，主要分布在人體的甲狀腺、甲狀旁腺、骨骼、腸道系統(tǒng)以及腎臟等器官中，能感應鈣離子的濃度，通過調節(jié)鈣離子的吸收和外排而維持人體中的鈣離子平衡。CaSR 的失活性突變會引起高血 鈣 疾 病, 如1 型家族性低尿鈣性高鈣血癥（FHH1）、 新 生 兒 嚴 重 甲 狀 旁 腺 亢 進 癥 (NSHPT) 和成年人原發(fā)性甲狀旁腺功能亢進癥 (PHPT) 等；CaSR的激活性突變還能引起低血鈣疾病,如 ADH1 和V 型巴特綜合征等。
CaSR除了能夠感受鈣離子外，它還能夠感受多種內源的氨基酸，氨基酸衍生物、多肽以及多胺化合物等。有關CaSR的生理、病理、細胞和生化研究已經(jīng)開展很多年了，但是由于CaSR的全長三維結構沒有得到解析，這些分子在結合到CaSR蛋白后，是起著激動劑（agonist）的作用還是扮演著正向變構調節(jié)劑（PAM）的作用，目前仍然不是很清楚。特別是配體結合CaSR胞外結構域之后如何將構象變化傳遞到跨膜結構域，以及全長CaSR蛋白的激活機制仍然不是很清楚，這些都極大限制了針對CaSR受體的相關藥物研發(fā)。
2021年2月18日，中國科學技術大學田長麟團隊與清華大學劉磊團隊聯(lián)合在Cell Research以長文（Article）形式在線發(fā)表了題為Structural mechanism of cooperative activation of the human calcium-sensing receptor by Ca2+ ions and L-tryptophan 的論文。該研究在國際上首次報道了人源全長鈣敏感受體CaSR蛋白在四種不同條件下的冷凍電鏡三維結構：不添加任何激動劑的“apo”-CaSR的inactive狀態(tài)電鏡結構；同時結合 L-Trp和 Ca2+兩種配體的激活 (active) 狀態(tài)的CaSR結構；單獨結合L-Trp的CaSR結構；單獨結合Ca2+的CaSR結構。通過結構分析首次闡明了CaSR的激活機制 (圖1)：L-Trp緊密結合在CaSR的VFT配體結合口袋中，誘導VFT從開放狀態(tài)變成關閉狀態(tài)；高濃度鈣離子結合到受體上，促使CaSR胞外的VFT結構域圍繞二體對稱軸發(fā)生扭轉；該扭轉通過剛性的CRD結構域傳遞到TMD，使TMD單體互相靠近形成TMD二聚體；CaSR形成激活態(tài)構象，為下游的G蛋白結合以及信號傳遞提供基礎。
圖1：鈣敏感受體CaSR在L-Trp和Ca2+兩種激動劑的共同作用下的激活機制
激活狀態(tài)CaSR的電鏡結構(3.5 Å)顯示受體同時結合了L-Trp和鈣離子兩種配體（圖2b），此外，VFT結構域還發(fā)現(xiàn)有六個氨基酸位點發(fā)生了翻譯后的糖基化修飾。激活狀態(tài)的CaSR整體結構比較緊湊，二體界面從胞外的VFT結構域和CDR結構域一直延伸到跨膜結構域（TMD）。CaSR激活態(tài)的結構顯示TMD以緊密的二聚體形式存在，其二體作用界面由跨膜螺旋TM6介導（圖2a）。該激活態(tài)TMD的結構特征與mGlu5和GABAB一致，在C家族GPCR中具有保守性。此外，ECL2與CRD相互作用，提高了CRD與TMD之間連接的剛性，在受體激活過程中發(fā)揮重要作用。
圖2：（a）激活態(tài)CaSR的電鏡密度圖以及整體結構。（b）結合在CaSR胞外結構域的L-Trp和Ca2+兩種激動劑的電鏡密度以及配位氨基酸信息。L-Trp顯示為黃色棒狀結構，Ca2+顯示為洋紅色球。
作者通過EDTA螯合二價金屬離子，并且在不添加其他激活劑的條件下制備了“apo”-CasR樣品。冷凍電鏡結構顯示“apo”-CaSR存在結構異質性，其胞外VFT結構域有三種不同構象：關關（inactive-close-close，Icc），開開（inactive-open-open, Ioo）和開關（inactive-open-close, Ioc）。其中Icc構象的VFT配體結合口袋中意外發(fā)現(xiàn)有一團電鏡密度，該密度是CaSR受體在表達過程中結合的天然本底氨基酸或者氨基酸衍生物。（圖3a）。文章作者進一步解析了只添加L-Trp的CaSR結構，該結構證實了以L-Trp為代表的的氨基酸是CaSR的激動劑，其功能是激動劑結合在VFT結構域的配體結合口袋中，從而誘導VFT從開放狀態(tài)變成關閉狀態(tài)（圖3b）。
圖3：（a）“apo”-CaSR的VFT結構域具有“開開”、“開關”和“關關”三種不同的構象，其中關閉構象（CaSR-Icc）的VFT中結合了本底氨基酸或氨基酸衍生物。（b）CaSR結合單獨的L-Trp配體，其結構呈現(xiàn)Icc構象。L-Trp結合在VFT的配體結合口袋中
為了研究單獨鈣離子對CaSR的激活作用，作者制備了單獨添加高濃度鈣離子的CaSR蛋樣品。電鏡結構解析結果非常令人意外，作者發(fā)現(xiàn)只添加鈣離子的CaSR蛋白也存在結構異質性（圖4a），有三種不同的構象：active（標注為CaSR- Ca2+）構象；Ioo（inactive-open-open）構象；Ioc（inactive-open-close）構象。這說明單獨的高濃度鈣離子并不能完全激活所有CaSR受體。而且值得注意的是，在激活狀態(tài)的CaSR結構中，VFT配體結合口袋中同樣有一團電鏡密度，其位置與CaSR-Trp結構中的L-Trp的電鏡密度一致 (圖4b)。這說明單獨加鈣離子產(chǎn)生的激活態(tài)構象CaSRca不僅結合了鈣離子，而且還結合了本底氨基酸或者氨基酸衍生物。進一步的功能實驗表明，對參與L-Trp配位的氨基酸進行突變會使CaSR受體基本喪失功能活性，這從側面驗證了L-Trp是CaSR的激活劑，其對CaSR蛋白的激活必不可少 (圖4c)。因此，作者提出一個觀點：CaSR受體的激活需要L-Trp（或者其他氨基酸及氨基酸衍生物）和鈣離子的共同協(xié)作。
圖4. （a）單獨結合鈣離子的CaSR具有構象異質性，分別為active構象（CaSR-Ca2+）、Ioo構象和Ioc構象。(b) CaSR-Ca2+結構的VFT配體結合口袋中結合了本底的氨基酸或者氨基酸衍生物。（c）細胞功能試驗顯示L-Trp對CaSR的激活必不可少。
CaSR是重要的藥物靶標，目前靶向CaSR的藥物有三種：小分子藥物Evocalcet和Cinacalcet，多肽藥物Etelcalcetide。這三種藥物都是鈣擬劑，是CaSR的變構激活劑，然而他們對CaSR的變構調節(jié)機制目前還不是很清楚。本研究中，作者首次展示了全長CaSR蛋白的高分辨三維結構，特別是之前從未報道過的TMD結構。該結構信息使得后續(xù)針對CaSR-TMD的別構調節(jié)藥物設計和開發(fā)變得更加高效和準確。
本研究工作由中國科學技術大學的田長麟團隊和清華大學的劉磊團隊通力合作共同完成。中國科學技術大學生命科學學院的副研究員凌盛龍、石攀、劉三玲和博士研究生孟憲禹為論文的共同作者，中國科學技術大學的田長麟教授、孫德猛副研究員和清華大學的劉磊教授為本文的共同通訊作者。
https://www.nature.com/articles/s41422-021-00474-0
中國科學技術大學田長麟團隊和清華大學劉磊團隊兩個課題組合作，綜合應用冷凍電鏡和GPCR功能實驗，解析了在不同配體結合條件下的人源Ca2+敏感受體CaSR的三維結構。首次揭示CaSR在L-Trp和鈣離子兩種激活劑的共同協(xié)作的激活機制。
田長麟等這項工作做了較長時間，工作量特別大。我一直關注他們的這項研究，特別提醒他們關注非氨基酸電鏡密度，從中可能發(fā)現(xiàn)蛋白質的化學修飾。在CaSR的冷凍電鏡結構解析過程中，研究人員仔細分析了電鏡密度數(shù)據(jù)，觀察到了CaSR的胞外結構域有多個多余的非氨基酸電鏡密度，結合這些氨基酸位點的確認，能初步推測是糖基化修飾。進一步應用糖基化修飾對接這些多余的電鏡密度，確認了這些位點的糖基化類型。前期相關功能研究結果表明，突變其中多個糖基化位點的氨基酸會嚴重影響CaSR的上膜和藥理學功能，說明這些位點的糖基化修飾對CaSR受體功能的重要性，值得進一步深入研究。
G蛋白偶聯(lián)受體（GPCR）是細胞信號轉導的重要膜受體蛋白，廣泛參與人體中的各種生理以及病理過程，是新藥開發(fā)的關鍵靶點蛋白，目前將近有30%的上市藥物都是靶向GPCR發(fā)揮藥效。哺乳動物GPCR可以分為五個亞家族，分別是視紫紅質樣受體（Rhodopsin）、分泌素樣受體（Secretin）、粘附蛋白受體（Adhesion）、代謝型谷氨酸樣受體（Glutamate）以及卷曲/味覺家族受體（Frizzled/taste2）。
代謝型谷氨酸樣受體亞家族又稱C型GPCR，該家族成員主要包括鈣敏感受體CaSR、代謝型谷氨酸受體mGluR、代謝型γ-氨基丁酸受體GABAB和味覺受體等。不同于其他亞家族GPCR通過單體就能產(chǎn)生生理功能，C型GPCR明確通過受體的二聚體發(fā)揮生理作用。截止目前，C型GPCR的成員中已經(jīng)有三個蛋白的結構被解析，除了本研究報道的CasR外，mGluR5 （Nature 2019）和GABAB (Nature 2020, Cell Research 2020) 的冷凍電鏡結構已于近期相繼被解析。
田長麟團隊與劉磊團隊合作研究通過解析四種不同條件下的CaSR蛋白結構，揭示了全長CaSR在激活過程中的完整構象變化過程，并且首次闡明了L-Trp和Ca2+兩種配體在激活CaSR受體中的功能作用，從結構上完善了鈣敏感受體CaSR的激活機制。通過比較分析可以發(fā)現(xiàn)這三個受體（mGluR5, GABAB, CaSR）的非活性狀態(tài)和活性狀態(tài)的TMD結構域在構象上具有一定共性：在非活性狀態(tài)的結構中，受體的兩個TMD單體互相分隔較遠，沒有直接的相互作用界面，其最近的兩個跨膜螺旋都是TM5。而當受體結合激動劑被激活后，兩個TMD單體通過旋轉互相靠近，形成緊湊的TMD二聚體，它們的二體相互作用界面都是TM6-TM6。這些共性表明C型GPCR在激活的過程中，其TMD的構象重排具有一定的保守性。
除了構象變化的共性外，CaSR蛋白在激活過程中具有不同于其他C型GPCR受體的獨特性。mGluR5和GABAB的VFT結構域結合激動劑后就能完全激活受體，形成TMD二聚體。然而本研究發(fā)現(xiàn)CaSR受體的VFT結合L-Trp激動劑后只能誘導VFT由開放狀態(tài)變成關閉狀態(tài)，形成一種中間激活態(tài)構象。而CaSR二體的扭轉，以及TMD靠近形成完全激活態(tài)構象，則需要第二種激動劑Ca2+的結合。因此CaSR的完全激活需要L-Trp和Ca2+兩種激動劑共同協(xié)作完成。
雖然最近對C型GPCR受體的三維結構以及功能機制研究取得了一定進展，目前仍然沒有高分辨的C型GPCR與G蛋白的復合物結構被解析。目前所解析的A型與B型GPCR-G蛋白復合物全都是受體單體結構，那么G蛋白是如何結合到激活態(tài)的C型GPCR的二體TMD上的？一個C型GPCR受體是結合一個還是兩個G蛋白？受體與G蛋白的結合機制是否與典型的A家族GPCR相同？此外，正向或者負向變構調節(jié)劑是如何調控C型GPCR受體的？這些問題都將是C型GPCR蛋白領域的研究前沿和熱點。
中國科學技術大學田長麟團隊和清華大學劉磊團隊兩個課題組合作，應用冷凍電鏡技術在國際上首次解析了全長人源Ca2+敏感受體CaSR蛋白在四種不同條件下的三維結構。通過結構分析，首次闡明了L-Trp和Ca2+兩種激動劑協(xié)同激活CaSR受體的結構基礎。
該研究中有一個值得注意的發(fā)現(xiàn)，即 “apo”-CaSR的冷凍電鏡結構存在構象異質性，其胞外VFT結構域有三種不同構象：關關（inactive-close-close，Icc），開開（inactive-open-open,Ioo）和開關（inactive-open-close, Ioc）。其中Icc構象的VFT配體結合口袋中有一團電鏡密度，可能是CaSR表達過程中結合的天然本底氨基酸或者氨基酸衍生物，其對受體的結合力比較高，純化過程中很難去除。進一步的CaSR-Trp結構解析證實以L-Trp為代表的的氨基酸是CaSR的激動劑，其功能是誘導VFT結構域中的配體結合口袋關閉。該研究發(fā)現(xiàn)CaSR受體可以高親和力結合本底氨基酸或類似物配體，且不易被去除。這一現(xiàn)象非常值得關注，特別是設計針對CaSR的配體功能實驗時，必須考慮到本底氨基酸類配體的影響。
研究人員針對CaSR蛋白還觀察到了一個特殊現(xiàn)象：CaSR受體需要L-Trp（或者其他氨基酸及氨基酸衍生物）和Ca2+協(xié)同作用才能激活CaSR。研究人員解析了單獨Ca2+結合的CaSR結構，結果發(fā)現(xiàn)其構象也存在異質性，有三種構象：激活態(tài)（CaSR-ca），Ioo（inactive-open-open）和Ioc（inactive-open-close）構象。而且激活態(tài)CaSR除了結合鈣離子外，其VFT配體結合口袋中還發(fā)現(xiàn)了本底氨基酸配體的電鏡密度。這說明單獨加Ca2+并不能完全激活CaSR受體，其激活仍然需要氨基酸類配體的協(xié)同作用。長期以來,CaSR的功能研究認為高濃度Ca2+能夠單獨激活CaSR，這很可能是因為無意中忽視了本底氨基酸配體的存在，特別是這些氨基酸配體在細胞功能試驗的清洗過程中很難被完全去除。