鑒于近期收到多起N-亞硝胺雜質(zhì)出雙峰，客戶要求給一個(gè)相對(duì)專業(yè)或者官方的解釋，其實(shí)在往期文章《分享 | 西他列汀NTTP雜質(zhì)，你對(duì)核磁的疑惑都在這里！》中我們分析了亞硝胺結(jié)構(gòu)在核磁共振波譜中的一些特異表現(xiàn)。上文提到，由于N-N鍵具有部分雙鍵的性質(zhì)，當(dāng)亞硝胺所連接的N原子兩側(cè)取代基不同會(huì)存在Z/E異構(gòu)體的能量差異（下圖B1-B2構(gòu)象）。由于NMR是一種快速檢測(cè)技術(shù)可以在毫秒至秒的時(shí)間水平上對(duì)待測(cè)物體進(jìn)行檢測(cè)，這樣一個(gè)快速的時(shí)間尺度可以分辨出許多可以快速轉(zhuǎn)化的兩個(gè)待測(cè)物體。

但是核磁共振波譜儀相對(duì)高昂的價(jià)格，導(dǎo)致該設(shè)備的使用并不像高效液相色譜或者氣相色譜一樣廣泛。那么在更為常用的色譜類分析方法中亞硝胺雜質(zhì)的結(jié)果又是怎么樣的呢，亞硝胺的不同構(gòu)象異構(gòu)體是否會(huì)產(chǎn)生不同的色譜響應(yīng)信號(hào)呢？

其實(shí)這個(gè)答案是肯定的：在某些色譜條件下亞硝胺兩個(gè)構(gòu)象轉(zhuǎn)化速度會(huì)降低，即使高純度的亞硝胺樣品也會(huì)在色譜上跑成兩個(gè)峰。

圖1：亞硝胺構(gòu)象差異示例

在QCS標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研發(fā)中心生產(chǎn)的數(shù)百個(gè)亞硝胺雜質(zhì)中，顯示了液相色譜雙峰的結(jié)果。這些分子的不同構(gòu)相異構(gòu)體差異比較明顯，構(gòu)象轉(zhuǎn)化所需時(shí)間較長(zhǎng)，不同構(gòu)象異構(gòu)體可以在HPLC中得到很好的分離，液相結(jié)果顯現(xiàn)雙峰。通過LC-MS串聯(lián)，對(duì)兩個(gè)液相色譜峰信號(hào)進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，發(fā)現(xiàn)兩個(gè)峰的質(zhì)譜結(jié)果完全一致。

例如依那普利拉(Enalaprilat)是一個(gè)分子內(nèi)具有二級(jí)胺結(jié)構(gòu)的的藥物，該藥物的亞硝胺雜質(zhì)會(huì)在色譜中跑出兩個(gè)峰。本文將以該產(chǎn)品為例，分享亞硝胺構(gòu)象異構(gòu)體在液相色譜中的結(jié)果。

我中心完成依那普利拉亞硝胺雜質(zhì)的定向合成后，發(fā)現(xiàn)該產(chǎn)品在某些色譜條件下可以走出明顯的雙峰（圖2，保留時(shí)間分別為17min和20min），并對(duì)雙峰進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，確認(rèn)其組成一致（圖3）。最后結(jié)合核磁共振波譜數(shù)據(jù)（圖4），可以確認(rèn)該樣品僅含有那普利拉亞硝胺結(jié)構(gòu)，樣品純度很高。通過分析可以發(fā)現(xiàn)：分子內(nèi)二級(jí)胺兩側(cè)結(jié)構(gòu)差異較大，亞硝胺syn/anti(B1/B2)構(gòu)象異構(gòu)體能量差異較大并且轉(zhuǎn)化速率低，因此不同構(gòu)象異構(gòu)體在該色譜條件下可以被有效分離產(chǎn)生雙峰，其數(shù)據(jù)如下圖所示（但是需要注意的是，這兩個(gè)峰依舊是同一個(gè)化合物，兩個(gè)峰會(huì)相互轉(zhuǎn)化，參見核磁結(jié)果圖4）。

   圖2：依那普利拉亞硝胺雜質(zhì)液相色譜結(jié)果

圖3：依那普利拉亞硝胺雜質(zhì)質(zhì)譜結(jié)果

圖4：依那普利拉亞硝胺雜質(zhì)核磁共振氫譜結(jié)果

通過文獻(xiàn)調(diào)研，我們發(fā)現(xiàn)亞硝胺在色譜研究中雙峰是一個(gè)常見的現(xiàn)象，有多份研究論文和官方機(jī)構(gòu)文件均有提及該問題。例如：1996年法國(guó)F. Berthou 等人發(fā)表的研究（Journal of Chromatography A 1996, 727 (1), 83，圖5）顯示在優(yōu)化的色譜條件下非對(duì)稱的亞硝胺雜質(zhì)可以得到分離，由原來的單峰變成雙峰；并且在美國(guó)藥典《USP通則1469 亞硝胺雜質(zhì)》中也明確表示不對(duì)稱的亞硝胺NMBA、NEIPA在所列條件下有可能表現(xiàn)為雙峰（圖6）。

圖5：液相色譜分離亞硝胺不同構(gòu)象的案例文獻(xiàn)

圖6：美國(guó)藥典《USP通則1469 亞硝胺雜質(zhì)》

最后是我中心的一些亞硝胺案例的數(shù)據(jù)列表，這些樣品均可在特定條件下產(chǎn)生液相雙峰，色譜結(jié)果均經(jīng)過確認(rèn)可放心使用（下文僅摘取部分案例，如需詳細(xì)數(shù)據(jù)請(qǐng)聯(lián)系對(duì)應(yīng)銷售人員）。

關(guān)于核磁共振(NMR)與液相色譜(HPLC)在化學(xué)分析中各有不同的側(cè)重點(diǎn)，對(duì)于亞硝胺純品而言兩個(gè)方法的測(cè)量原理和維度各有差異。將兩個(gè)測(cè)量技術(shù)的典型差異簡(jiǎn)要總結(jié)如下表以供參考。