鑒于近期收到多起N-亞硝胺雜質出雙峰，客戶要求給一個相對專業(yè)或者官方的解釋，其實在往期文章《分享 | 西他列汀NTTP雜質，你對核磁的疑惑都在這里！》中我們分析了亞硝胺結構在核磁共振波譜中的一些特異表現(xiàn)。上文提到，由于N-N鍵具有部分雙鍵的性質，當亞硝胺所連接的N原子兩側取代基不同會存在Z/E異構體的能量差異（下圖B1-B2構象）。由于NMR是一種快速檢測技術可以在毫秒至秒的時間水平上對待測物體進行檢測，這樣一個快速的時間尺度可以分辨出許多可以快速轉化的兩個待測物體。
但是核磁共振波譜儀相對高昂的價格，導致該設備的使用并不像高效液相色譜或者氣相色譜一樣廣泛。那么在更為常用的色譜類分析方法中亞硝胺雜質的結果又是怎么樣的呢，亞硝胺的不同構象異構體是否會產生不同的色譜響應信號呢？
其實這個答案是肯定的：在某些色譜條件下亞硝胺兩個構象轉化速度會降低，即使高純度的亞硝胺樣品也會在色譜上跑成兩個峰。
圖1：亞硝胺構象差異示例
在QCS標準物質研發(fā)中心生產的數(shù)百個亞硝胺雜質中，顯示了液相色譜雙峰的結果。這些分子的不同構相異構體差異比較明顯，構象轉化所需時間較長，不同構象異構體可以在HPLC中得到很好的分離，液相結果顯現(xiàn)雙峰。通過LC-MS串聯(lián)，對兩個液相色譜峰信號進行質譜鑒定，發(fā)現(xiàn)兩個峰的質譜結果完全一致。
例如依那普利拉(Enalaprilat)是一個分子內具有二級胺結構的的藥物，該藥物的亞硝胺雜質會在色譜中跑出兩個峰。本文將以該產品為例，分享亞硝胺構象異構體在液相色譜中的結果。
我中心完成依那普利拉亞硝胺雜質的定向合成后，發(fā)現(xiàn)該產品在某些色譜條件下可以走出明顯的雙峰（圖2，保留時間分別為17min和20min），并對雙峰進行質譜鑒定，確認其組成一致（圖3）。最后結合核磁共振波譜數(shù)據(jù)（圖4），可以確認該樣品僅含有那普利拉亞硝胺結構，樣品純度很高。通過分析可以發(fā)現(xiàn)：分子內二級胺兩側結構差異較大，亞硝胺syn/anti(B1/B2)構象異構體能量差異較大并且轉化速率低，因此不同構象異構體在該色譜條件下可以被有效分離產生雙峰，其數(shù)據(jù)如下圖所示（但是需要注意的是，這兩個峰依舊是同一個化合物，兩個峰會相互轉化，參見核磁結果圖4）。
圖2：依那普利拉亞硝胺雜質液相色譜結果
圖3：依那普利拉亞硝胺雜質質譜結果
圖4：依那普利拉亞硝胺雜質核磁共振氫譜結果
通過文獻調研，我們發(fā)現(xiàn)亞硝胺在色譜研究中雙峰是一個常見的現(xiàn)象，有多份研究論文和官方機構文件均有提及該問題。例如：1996年法國F. Berthou 等人發(fā)表的研究（Journal of Chromatography A 1996, 727 (1), 83，圖5）顯示在優(yōu)化的色譜條件下非對稱的亞硝胺雜質可以得到分離，由原來的單峰變成雙峰；并且在美國藥典《USP通則1469 亞硝胺雜質》中也明確表示不對稱的亞硝胺NMBA、NEIPA在所列條件下有可能表現(xiàn)為雙峰（圖6）。
圖5：液相色譜分離亞硝胺不同構象的案例文獻
圖6：美國藥典《USP通則1469 亞硝胺雜質》
最后是我中心的一些亞硝胺案例的數(shù)據(jù)列表，這些樣品均可在特定條件下產生液相雙峰，色譜結果均經過確認可放心使用（下文僅摘取部分案例，如需詳細數(shù)據(jù)請聯(lián)系對應銷售人員）。
關于核磁共振(NMR)與液相色譜(HPLC)在化學分析中各有不同的側重點，對于亞硝胺純品而言兩個方法的測量原理和維度各有差異。將兩個測量技術的典型差異簡要總結如下表以供參考。
