蛋白酶K(Proteinase K)在這幾年間走入大眾視野，但在此之前的不少研究實(shí)驗(yàn)中，它已然是十分重要的存在。蛋白酶K，屬于絲氨酸蛋白酶類(lèi)，具有極高的酶活性和廣泛的底物特異性。

在原位雜交技術(shù)中通常用于雜交前的樣品處理，它具有消化包圍靶DNA蛋白質(zhì)的作用，能增加探針與靶核酸結(jié)合的機(jī)會(huì)，提高雜交信號(hào)。在DNA提取中，主要作用是酶解與核酸結(jié)合的組蛋白，使DNA游離在溶液中，隨后用不同方法進(jìn)行抽提，除去雜質(zhì)，收集DNA。

圖  蛋白酶K關(guān)鍵催化位點(diǎn)

蛋白酶K應(yīng)用率較高，雖說(shuō)其穩(wěn)定性也很高，但在實(shí)際應(yīng)用中，總會(huì)發(fā)現(xiàn)蛋白酶K不能帶來(lái)很好的功效，如何用好蛋白酶K，希望本篇文章能夠幫到正在實(shí)驗(yàn)中遇到問(wèn)題的小伙伴們。

【Q&A】

Q1：蛋白酶K的適配pH范圍是多少？

A: 蛋白酶K在較廣的pH范圍內(nèi)均有活性，金普諾安推薦pH范圍為7.5-11.5。

Q2：蛋白酶K合適溫度推薦是多少？

A: 推薦溫度范圍是37-70℃，70℃時(shí)活性處于頂峰。

Q3：干粉蛋白酶K如何配制？

A: 將蛋白酶K固體溶解于稀釋緩沖液[20mM Tris-HCl（pH 7.4），1mM CaCl₂，2%甘油]中，配制成20-40mg/ml溶液，在消化液或裂解液中添加蛋白酶K至終濃度為50-200μg/ml；蛋白酶K溶液若需反復(fù)使用，需分裝保存，避免反復(fù)凍融。

Q4：蛋白酶K的儲(chǔ)存條件？

A: 凍干粉可于4℃以下干燥環(huán)境中儲(chǔ)存有效期3年；液體有效期1年，打開(kāi)包裝使用后，如果在2～8ºC環(huán)境下放置超過(guò)1周時(shí)間，建議過(guò)濾除菌，防止微生物污染。

Q5：干粉溶解后保存需要特殊的保護(hù)劑嗎？

A: 溶解于稀釋/儲(chǔ)存緩沖液后，不再需要特殊的保護(hù)劑。

Q6：若實(shí)驗(yàn)樣本為復(fù)雜樣本，想要提取核酸，需要用蛋白酶K處理嗎？

A: 推薦使用，如痰液、糞便類(lèi)樣本，可能存在可抑制PCR反應(yīng)的物質(zhì)（糖蛋白、免疫球蛋白等），及殘留較多RNA酶。使用蛋白酶K可大程度滅活RNA酶，防止病毒RNA的降解，提高RNA回收率。

Q7：能否說(shuō)下蛋白酶K的濃度對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響？

A: 蛋白酶K在原位雜交技術(shù)中通常用于雜交前的處理，但若濃度過(guò)高、消化時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或孵育溫度過(guò)高時(shí)，會(huì)對(duì)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)有一定的破壞，導(dǎo)致組織切片的脫落，細(xì)胞核的消失，從而影響雜交結(jié)果。

而在DNA提取中，若蛋白酶K濃度過(guò)低，就會(huì)影響蛋白質(zhì)的水解程度，導(dǎo)致提出的DNA含量和純度都會(huì)受到影響。

Q8：蛋白酶K的抑制劑和激活劑有哪些？

A: 抑制劑：二異丙基氟磷酸（DIFP），苯甲基磺酰氟（PMSF）；

    激活劑：1-5mM Ca ²⁺；

Ca²⁺可以保護(hù)蛋白酶K不會(huì)自我降解、增加蛋白酶K的熱穩(wěn)定性、調(diào)節(jié)蛋白酶K的底物結(jié)合位點(diǎn)；對(duì)于難處理、需長(zhǎng)期處理的樣本（如運(yùn)用于病毒保存液中時(shí)），因?yàn)樘幚頃r(shí)間較長(zhǎng)，對(duì)蛋白酶K的鈣離子依賴(lài)性有較大改進(jìn)需求。

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結(jié)語(yǔ)：蛋白酶K應(yīng)用廣泛，包括且不僅限于皮革、毛皮、絲綢、醫(yī)藥、食品、釀造等方面。以上為大家介紹的就是蛋白酶K在使用過(guò)程中的注意要點(diǎn)，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中與其接觸會(huì)造成皮膚過(guò)敏反應(yīng)，為了安全和健康考慮，使用時(shí)需務(wù)必穿好實(shí)驗(yàn)服，佩戴好防護(hù)手套和護(hù)目鏡等進(jìn)行操作。