在雜質(zhì)的研究中，除了對(duì)雜質(zhì)做定性研究之外，很多時(shí)候也需要做定量方面的研究，從而能比較準(zhǔn)確地了解雜質(zhì)的真實(shí)含量，和高效液相數(shù)據(jù)的匹配度如何，為進(jìn)一步把控藥物工藝路線中的中間體、終產(chǎn)API和藥物制劑中所含有的雜質(zhì)提供更可靠的事實(shí)依據(jù)。目前，國(guó)內(nèi)雜質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品的定量研究，主要采用兩種方法：質(zhì)量平衡法，包括熱重分析（Thermogravimetric Analysis，TG或TGA）技術(shù)以及水分加溶劑殘留技術(shù)；另外就是定量核磁（Quantitative Nuclear Magnetic）方法。在SINCO藥物標(biāo)準(zhǔn)品研究和銷售中，很多客戶會(huì)要求選擇上述方法之一來(lái)對(duì)要購(gòu)買的藥物雜質(zhì)進(jìn)行定量分析。
作為一門近年來(lái)比較熱門的分析技術(shù)，如果不能很好地理解它的技術(shù)特點(diǎn)和要求，難免會(huì)引起認(rèn)知上的困擾和檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，影響與客戶的順利溝通。結(jié)合我們工作中遇到的一些問(wèn)題，糅合相關(guān)信息資料，拋磚引玉，談?wù)勎覀儗?duì)定量核磁的一些淺顯認(rèn)識(shí)。
整個(gè)定量核磁的檢測(cè)過(guò)程包括：待測(cè)樣品和標(biāo)準(zhǔn)樣品（內(nèi)標(biāo)物）的準(zhǔn)備，樣品的稱量，配（氘代溶）液和轉(zhuǎn)移，進(jìn)行qNMR檢測(cè)，數(shù)據(jù)處理與計(jì)算這五個(gè)步驟（圖1）。我們知道分析誤差是可以疊加的，分析過(guò)程中每一個(gè)步驟產(chǎn)生的誤差，會(huì)最終加合到一起，所以需要從最開(kāi)始的樣品稱量就要力爭(zhēng)免除不必要的誤差。
圖1. qNMR檢測(cè)流程
具體來(lái)說(shuō)，稱量的時(shí)候要做到如下要求：
1.使用按規(guī)范校準(zhǔn)過(guò)的超微量天平（即十萬(wàn)分之一天平）；
2.稱量前要清潔桌面；
3.稱量前要把天平的稱量臺(tái)面清潔干凈；
4.稱量時(shí)使用鑷子，而不是直接用手（手指會(huì)沾染樣品，造成樣品量損失）；
5.在第一次稱量前，先將一個(gè)空樣品瓶放在天平稱量臺(tái)面數(shù)分鐘；
6.檢查天平附近有沒(méi)有磁性物體；
7.用邊緣比較薄的樣品瓶稱量；
8.稱量前，輕輕地敲擊樣品瓶，使得粘附的樣品抖落到瓶底；
9.樣品瓶在稱量臺(tái)上的時(shí)候，不要往瓶里加樣品；
10.稱量時(shí)完全關(guān)閉天平門，杜絕氣流的影響；
11.調(diào)零前，要等天平顯示數(shù)據(jù)先穩(wěn)定下來(lái)；
12.將樣品瓶?jī)?chǔ)存在天平附近；
13.為避免誤差過(guò)大，樣品稱量的量>10 mg為宜。
PART1---標(biāo)準(zhǔn)樣品或內(nèi)標(biāo)物的選擇：
標(biāo)準(zhǔn)樣品或內(nèi)標(biāo)物通常結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，有一組或兩組核磁出峰。具有較高的純度（≥99%），吸濕性不強(qiáng)，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，可以長(zhǎng)久保存，不揮發(fā)，且溶于指定的氘代溶劑中，不與待測(cè)樣品的定量峰互相干擾重疊。因?yàn)橛胁糠謨?nèi)標(biāo)物仍會(huì)微量吸潮，所以內(nèi)標(biāo)物要求置于干燥器中保存。
下面表格是幾種常用內(nèi)標(biāo)物的相關(guān)數(shù)據(jù)歸納，可以供研究人員參考選擇：
表1：常用定量核磁標(biāo)準(zhǔn)品
PART2---氘代溶液配制：
氘代溶劑一般根據(jù)內(nèi)標(biāo)物及待測(cè)樣品的性質(zhì)來(lái)定。盡可能消除活潑質(zhì)子的影響，使樣品完全溶解：
1. 不含活潑質(zhì)子的非極性化合物，可選用氘代氯仿做溶劑；
2. 含活潑質(zhì)子的極性化合物，常用的溶劑有DMSO-d6+D2O(加重水是為了消除活潑質(zhì)子的影響)、D2O和CD3OD等；
3. 如果用DMSO-d6+D2O作溶劑，一般兩者的比例為5:1。兩者比例可做適當(dāng)調(diào)整，保證混合樣品完全溶解；
4. 既不溶于有機(jī)溶劑，也不溶于水，比如氨基酸類兩性化合物等，可以采用DMSO-d6/D2O+酸/堿的方法。需要保證酸/堿不會(huì)影響待測(cè)物和內(nèi)標(biāo)的穩(wěn)定性；
5. 對(duì)于一些特殊結(jié)構(gòu)的樣品，如果其特征信號(hào)在水峰附近，很難保證基線的水平，會(huì)影響測(cè)定結(jié)果。可用的方法是加入TFA移除水峰。需要保證TFA不影響待測(cè)物的穩(wěn)定。
PART3---qNMR檢測(cè)：
進(jìn)行qNMR檢測(cè)的時(shí)候，因?yàn)榭紤]到要對(duì)峰面積精準(zhǔn)積分，所以檢測(cè)方法的一些數(shù)據(jù)設(shè)定也有要求（核磁檢測(cè)軟件中進(jìn)行設(shè)置，此處不做介紹）。一般要求D1>5T1；S/N>150 (即信噪比)。T1（即弛豫時(shí)間）一般為1s，D1（即延遲時(shí)間）一般選5-10s。延遲時(shí)間（D1）直接影響激發(fā)核能否恢復(fù)至平衡基態(tài)，而能否恢復(fù)基態(tài)影響核磁的響應(yīng)信號(hào)。因此合適的D1對(duì)qNMR定量結(jié)果影響較大。但過(guò)長(zhǎng)的D1又會(huì)增加單次掃描所需的時(shí)間。
在實(shí)際操作中，如需縮短延遲時(shí)間，可以通過(guò)加入順磁物質(zhì)。而如果D1過(guò)短，可以引入校正因子f校正D1時(shí)間不足導(dǎo)致的定量偏差。就掃描時(shí)間而言，相同操作條件下，靈敏度與掃描次數(shù)呈正比。如果掃描次數(shù)太少，數(shù)據(jù)重現(xiàn)性會(huì)較差。但如果掃描次數(shù)過(guò)多，則會(huì)造成試驗(yàn)效率低下。因此qNMR定量需優(yōu)化掃描次數(shù)，是掃描時(shí)間和靈敏度達(dá)到最佳平衡。
PART4---數(shù)據(jù)處理與計(jì)算：
牽扯到數(shù)據(jù)分析的時(shí)候，因?yàn)榇郎y(cè)樣品往往出峰復(fù)雜，所以選擇哪個(gè)或哪幾個(gè)核磁峰為定量峰也有講究。一般盡可能保證信號(hào)峰間的基線分離；定量峰峰形盡可能類似；定量峰盡可能靠近（如果標(biāo)準(zhǔn)樣品峰與定量峰相隔太遠(yuǎn)，對(duì)基線校正的要求極高，誤差大）；二者峰面積盡可能接近；衛(wèi)星峰盡可能不干擾測(cè)定結(jié)果等。另外標(biāo)準(zhǔn)樣品和待測(cè)樣品的摩爾量（有效）要接近，不然誤差也是比較大的。這些對(duì)于含量比較高的API或其工作對(duì)照品，影響會(huì)比較明顯。
對(duì)于待測(cè)樣品和標(biāo)準(zhǔn)樣品，其中一個(gè)或兩者均有一個(gè)以上可用定量峰的情況下，需做合理選擇。如果同一成分的可用定量峰的積分值接近，可取其平均值；如果其積分值有一定差距，建議采用積分值小的那個(gè)，一般結(jié)果比較合理。
以上是SINCO藥物標(biāo)準(zhǔn)品相關(guān)分析研究人員在定量核磁的檢測(cè)和分析中，綜合有關(guān)文獻(xiàn)信息，加上自身經(jīng)驗(yàn)的總結(jié)，得到的一些淺薄認(rèn)知，希望能和國(guó)內(nèi)的眾多標(biāo)準(zhǔn)品研究人員相互學(xué)習(xí)，共同進(jìn)步。
Sinco Pharmachem（簡(jiǎn)稱SINCO），專業(yè)為化學(xué)藥物領(lǐng)域的科學(xué)家提供復(fù)雜有機(jī)小分子化合物、雜質(zhì)對(duì)照品、API標(biāo)準(zhǔn)品、穩(wěn)定同位素。
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