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類器官RNA和蛋白提取方法
發(fā)布日期:2023/10/19 16:11:20發(fā)布人:愛必信(上海)生物科技有限公司

很多老師咨詢類器官RNA和蛋白如何提取,其實(shí)類器官可以按微小組織進(jìn)行RNA和蛋白提取,今天小愛給大家講一講提取方法。

 

類器官蛋白提取方法

 

一、試劑準(zhǔn)備(細(xì)胞漿、細(xì)胞核及細(xì)胞膜蛋白抽提試劑盒(abs9346)

 

1、準(zhǔn)備溶液

1)室溫融解試劑盒中的各種溶液,溶解后除結(jié)構(gòu)蛋白提取液外,其他試劑立即置于冰上;

2)結(jié)構(gòu)蛋白提取液溶解后,可放置于37℃水浴中溫浴至透明后,常溫放置。

 

2、蛋白提取工作液的準(zhǔn)備

1)胞漿蛋白提取工作液的準(zhǔn)備:臨用前,根據(jù)處理樣品的量估算實(shí)驗(yàn)時(shí)胞漿蛋白提取液的需要量,并分別按照1:50比例加入磷酸酶抑制劑II和1:100比例加入蛋白酶抑制劑PMSF;

2)胞核蛋白提取工作液的準(zhǔn)備:臨用前,根據(jù)處理樣品的量估算實(shí)驗(yàn)時(shí)胞核蛋白提取液的需要量,并分別按照1:50比例加入磷酸酶抑制劑II和1:100比例加入蛋白酶抑制劑PMSF;

3)膜蛋白提取工作液的準(zhǔn)備:臨用前,根據(jù)處理樣品的量估算實(shí)驗(yàn)時(shí)膜蛋白提取液的需要量,并分別按照1:50比例加入磷酸酶抑制劑II和1:100比例加入蛋白酶抑制劑PMSF;

4)結(jié)構(gòu)蛋白提取工作液的制備:臨用前,根據(jù)處理樣品的量估算實(shí)驗(yàn)時(shí)結(jié)構(gòu)蛋白提取液的需要量,并分別按照1:50比例加入磷酸酶抑制劑II和1:100比例加入蛋白酶抑制劑PMSF。

 

二、類器官收集及洗滌

 

1、類器官收集

 

移液器吸去培養(yǎng)基,每孔添加1-2mL左右4℃類器官傳代培養(yǎng)緩沖液(abs9730),輕柔吹打基質(zhì)膠,收集在15mL離心管中(24孔板,每5孔為一組),4℃靜置10min或-20℃放置5min(目的是使基質(zhì)膠軟化),300g ,4℃, 離心5min棄上清。

 

 

2、類器官清洗

 

添加1mL類器官傳代培養(yǎng)緩沖液重懸,300g ,4℃,離心5min棄上清。

 

 

三、類器官蛋白提取

 

1、胞漿蛋白提取

1)向含類器官沉淀的EP中加入2mL的胞漿蛋白提取工作液,在4℃條件下震蕩20min;

2)準(zhǔn)備1-5mL的注射器,用注射器吹打步驟1震蕩過的溶液50-90次,在4℃條件下,15000g離心10min。取上清液存于EP管中,即為胞漿蛋白。

 

2、胞核蛋白的提取

取3.1.2步驟獲得的沉淀物加入4mL冰浴的胞漿蛋白提取工作液,在4℃條件下震蕩5min,4℃條件下15000g離心10min,棄去上清液,沉淀物中加入1mL冰凍的胞核蛋白提取工作液,在4℃條件下震蕩5min,4℃條件下15000g離心10min,上清液為細(xì)胞核蛋白,轉(zhuǎn)入EP管并保存。

 

3、胞膜蛋白的提取

在步驟3.2中的沉淀物中加入1mL冰凍的膜蛋白提取工作液,在4℃條件下震蕩5min,4℃條件下15000g離心10min,上清液為細(xì)胞膜蛋白,轉(zhuǎn)入EP管并保存。

 

4、結(jié)構(gòu)蛋白的提取

在步驟3.3的沉淀物中加入常溫或37℃水浴過的透明的結(jié)構(gòu)蛋白提取工作液0.5mL,4℃條件下震蕩5min,4℃條件下15000g離心10min,保存上清液即為細(xì)胞骨架蛋白。

 

5、待測(cè)蛋白的保存待檢測(cè)濃度的蛋白存于-70℃,可以用于Western,EMSA,footprinting,報(bào)告基因檢測(cè)以及酶活力測(cè)定等后續(xù)操作。

更多實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng) 細(xì)胞漿、細(xì)胞核及細(xì)胞膜蛋白抽提試劑盒 產(chǎn)品說明書 (absin.cn)

 

類器官RNA提取方法

 

一、類器官收集及洗滌

 

1、類器官收集

 

移液器吸去培養(yǎng)基,每孔添加1-2mL左右4℃類器官傳代培養(yǎng)緩沖液(abs9730),輕柔吹打基質(zhì)膠,收集在15mL離心管中(24孔板,每5孔為一組),4℃靜置10min或-20℃放置5min(目的是使基質(zhì)膠軟化),300g ,4℃, 離心5min棄上清。

 

 

2、類器官清洗

 

添加1mL類器官傳代培養(yǎng)緩沖液重懸,轉(zhuǎn)移到1.5mL EP管,300g ,4℃,離心5min棄上清。

 

 

二、類器官RNA提取(超純總RNA快速提取試劑盒(含DNase I),貨號(hào)abs60026

 

1、向含類器官沉淀的EP中加入1mL的RL(試劑盒組分)溶解細(xì)胞,并用移液槍輕輕吹打混勻,使RL充分和類器官接觸裂解細(xì)胞并滅活RNA酶;
2、將勻漿樣品劇烈震蕩混勻,在15-30°C條件下孵育5min以使核蛋白體完全分解;
3、每1mL RL加0.2mL氯仿。蓋緊樣品管蓋,劇烈振蕩15sec并將其在室溫下孵育3min;
4、于4℃,12000 rpm離心10min,樣品會(huì)分成三層:下層有機(jī)相,中間層和上層無色的水相,RNA存在于水相中。水相層的容量大約為所加RL體積的60%,把水相轉(zhuǎn)移到新管中,進(jìn)行下一步操作;
5、加入1倍體積70%乙醇(請(qǐng)先檢查是否已加入無水乙醇!),顛倒混勻(此時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)沉淀)。得到的溶液和可能沉淀一起轉(zhuǎn)入吸附柱RA中(吸附柱套在收集管內(nèi));
6、12000 rpm 離心45sec,棄廢液,將吸附柱重新套回收集管;
7、加400μL去蛋白液RE,12000 rpm 離心45sec,棄廢液;
8、DNase I工作液的配制:取10μL DNase I儲(chǔ)存液放入新的RNase-free離心管中,加入70μL RDD溶液,輕柔混勻;
9、向吸附柱RA中央加入80μL DNase I工作液,室溫放置15min(一般情況下室溫放置可得到較好的消化效果,如果室溫效果不佳可選擇在37℃放置15min);
10、加400μL去蛋白液RE,12000 rpm 離心45sec,棄掉廢液;
11、加入500μL漂洗液RW(請(qǐng)先檢查是否已加入無水乙醇?。?,12000 rpm離心45sec, 棄掉廢液;
12、加入500μL漂洗液RW,12000 rpm 離心45sec,棄掉廢液;
13、將吸附柱RA放回空收集管中,12000 rpm離心2min,盡量除去漂洗液,以免漂洗液中殘留乙醇抑制下游反應(yīng);
14、取出吸附柱RA,放入一個(gè)RNase free離心管中,根據(jù)預(yù)期RNA產(chǎn)量往吸附膜的中間部位加50-80μL RNase free H2O(事先在 65℃水浴中加熱效果更好),室溫放置2min,12000 rpm 離心1min,所得溶液即為RNA溶液。如果需要較多RNA,可將得到的溶液重新加入離心吸附柱中,離心1min。

 

更多實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng) 超純總RNA快速提取試劑盒(含DNase I)產(chǎn)品說明書 (absin.cn)

 

提取得到的RNA溶液,可以直接應(yīng)用于Northern 雜交、RT-PCR、Real Time RT-PCR、cDNA文庫(kù)構(gòu)建、體外翻譯等各種常規(guī)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。

 

今天講解就到這了,大家如有實(shí)驗(yàn)問題,歡迎入群交流哦!


 

本期小愛推薦:

貨號(hào)

品名

規(guī)格

細(xì)胞漿、細(xì)胞核及細(xì)胞膜蛋白抽提試劑盒

50T

超純總RNA快速提取試劑盒(含DNase I)

20T/50T

類器官傳代培養(yǎng)緩沖液

250ml/ 250ml

基質(zhì)膠(低因子、無酚紅)

1.5ml*4/ 1.5ml*8

Organotial人肝癌類器官培養(yǎng)基試劑盒

1kit

Organotial人結(jié)直腸癌類器官培養(yǎng)基試劑盒

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Organotial人胃癌類器官培養(yǎng)基試劑盒

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Organotial人胰腺癌類器官培養(yǎng)基試劑盒

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Organotial人鼻咽癌類器官培養(yǎng)基試劑盒

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Organotial人腦膠質(zhì)瘤類器官培養(yǎng)基試劑盒

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Organotial人乳腺癌類器官培養(yǎng)基試劑盒

1kit

 

 

 

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