動(dòng)物活體成像技術(shù)主要包括生物發(fā)光與熒光發(fā)光兩種技術(shù)。生物發(fā)光是利用熒光素酶基因標(biāo)記DNA，通過(guò)基因表達(dá)產(chǎn)生的蛋白酶與相應(yīng)底物發(fā)生化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生光信號(hào)（圖1）。熒光發(fā)光采用熒光物質(zhì)或熒光物質(zhì)標(biāo)記的抗體、納米材料、藥物等導(dǎo)入到活體體內(nèi)，通過(guò)外界激發(fā)光源激發(fā)獲取成像。
圖1 生物發(fā)光活體成像檢測(cè)原理
通過(guò)活體成像技術(shù)可以觀測(cè)活體動(dòng)物體內(nèi)腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移、炎癥的發(fā)生、特定基因的表達(dá)和藥物作用效果等生物學(xué)過(guò)程。前期小愛(ài)介紹了兩種活體發(fā)光成像技術(shù)在科學(xué)研究中的應(yīng)用案例，我們可以根據(jù)自己的實(shí)驗(yàn)需求結(jié)合技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)（表1）選擇合適的體內(nèi)發(fā)光技術(shù)。
表1 生物發(fā)光與熒光發(fā)光成像技術(shù)優(yōu)缺點(diǎn)
實(shí)時(shí)長(zhǎng)期監(jiān)測(cè)體內(nèi)的各種生物學(xué)過(guò)程；
背景噪聲低，靈敏度高；
無(wú)放射性，不損傷體內(nèi)正常細(xì)胞。
成本較高；
波長(zhǎng)短穿透力差；
細(xì)胞構(gòu)建耗時(shí)費(fèi)力。
基因表達(dá)，細(xì)胞、病毒和細(xì)菌示蹤等。
簡(jiǎn)單、方便、價(jià)廉；
標(biāo)記靶點(diǎn)多樣；
易于被大多數(shù)研究人員接受。
背景噪音強(qiáng)，靈敏度低；
染料可能有毒性。
基因表達(dá)，蛋白和小分子、細(xì)胞、病毒和細(xì)菌示蹤等。
本期小愛(ài)以生物發(fā)光成像實(shí)驗(yàn)為例帶大家一起學(xué)習(xí)動(dòng)物活體成像實(shí)驗(yàn)具體操作流程。
一個(gè)完整的生物發(fā)光活體成像過(guò)程包括構(gòu)建熒光素酶重組質(zhì)粒、細(xì)胞轉(zhuǎn)染和篩選、熒光素酶活性鑒定陽(yáng)性克隆，再將陽(yáng)性克隆細(xì)胞移植到體內(nèi)建立動(dòng)物模型，進(jìn)而通過(guò)小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)檢測(cè)動(dòng)物體內(nèi)特定部位發(fā)出的熒光信號(hào)。最后取出腫瘤組織，通過(guò)染色進(jìn)行病理形態(tài)學(xué)分析。
1、構(gòu)建熒光素酶重組質(zhì)粒
含熒光素酶的重組質(zhì)粒根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求可以自己實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建，也可以來(lái)源于其它實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)或市售。
2、細(xì)胞轉(zhuǎn)染和篩選
常用的細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法是化學(xué)轉(zhuǎn)染法，對(duì)于一些較難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞（如原代細(xì)胞、干細(xì)胞、不分化的細(xì)胞等），可以使用轉(zhuǎn)染增強(qiáng)劑聚凝胺(abs42025397)來(lái)提高轉(zhuǎn)染效率。按照轉(zhuǎn)染試劑盒說(shuō)明書(shū)的操作步驟進(jìn)行轉(zhuǎn)染即可。
為篩選穩(wěn)定表達(dá)目的蛋白的細(xì)胞株，需要確定能夠殺死未轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞的抗生素最低濃度，可以通過(guò)建立殺滅曲線來(lái)實(shí)現(xiàn)，我們以G-418(abs44062790)篩選濃度的確定為例。
1）天：處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞按照20-25%的細(xì)胞密度（對(duì)于需要更高密度來(lái)檢測(cè)活力的細(xì)胞，可增加接種量）。鋪在合適的培養(yǎng)板上，37℃，CO2培養(yǎng)過(guò)夜；
2）根據(jù)細(xì)胞類(lèi)型，設(shè)定合適范圍內(nèi)的濃度梯度。以哺乳動(dòng)物細(xì)胞為例，可設(shè)定0，50，100，200，400，800，1000μg/mL；
3）第二天：去除舊的培養(yǎng)基，換用新鮮配制的含有相應(yīng)濃度G-418的培養(yǎng)基。每個(gè)濃度做三個(gè)平行孔；
4） 接下來(lái)每3-4天更換新的含G-418的培養(yǎng)基；
5）按照固定的周期（如每2天）進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)來(lái)確定阻止未轉(zhuǎn)染細(xì)胞生長(zhǎng)的恰當(dāng)濃度。選擇在理想的天數(shù)（通常是7-10天）內(nèi)能夠殺死絕大多數(shù)細(xì)胞的最低濃度為穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞篩選用的工作濃度。
3、熒光素酶活性鑒定陽(yáng)性克隆
篩選的單一抗性克隆傳代至第五代時(shí)用多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)熒光素酶活性。
1）按1×105個(gè)/孔接種到24孔板，24h后裂解細(xì)胞，12000rpm，4℃離心10min，收集裂解物；
2）取上清10μL加入96孔白板中，向每孔加入50μL熒光素酶底物，反應(yīng)片刻讀取熒光值，每個(gè)克隆設(shè)3個(gè)復(fù)孔；
3）保留熒光值高的細(xì)胞克隆繼續(xù)傳代培養(yǎng)，再過(guò)5代后進(jìn)行熒光素酶活性檢測(cè)。保留熒光值維持較高的克隆直至第30代，熒光素酶活性最高的幾個(gè)克隆即為陽(yáng)性克隆。
需要注意的是，篩選的陽(yáng)性克隆細(xì)胞數(shù)理論上應(yīng)與發(fā)光強(qiáng)度具有線性相關(guān)性，并且陽(yáng)性克隆細(xì)胞應(yīng)和未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞具有相似的生長(zhǎng)趨勢(shì)。因此，我們?cè)诖_定陽(yáng)性克隆細(xì)胞系后可以增加這兩個(gè)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)以確保整個(gè)實(shí)驗(yàn)的完整性和可靠性。
4、動(dòng)物模型構(gòu)建
篩選陽(yáng)性克隆細(xì)胞株后，通常需要將細(xì)胞注射到動(dòng)物體內(nèi)構(gòu)建模型，通過(guò)體內(nèi)成像觀察腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。但是也需要根據(jù)腫瘤類(lèi)型和研究目的，選擇最適合的模型。一般腫瘤細(xì)胞的注射方式包括以下幾種：
表2 常用腫瘤細(xì)胞注射方式
注射部位包括側(cè)腹面、背側(cè)面及腋下。
腫瘤細(xì)胞注射到小鼠腹腔。通常會(huì)引起一定程度的腹水及浸潤(rùn)性轉(zhuǎn)移。
適合某些腫瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程，如卵巢癌。
腫瘤細(xì)胞經(jīng)尾靜脈注射，通過(guò)肺部的毛細(xì)血管網(wǎng)進(jìn)入動(dòng)脈血液循環(huán)系統(tǒng)，造成全身多發(fā)轉(zhuǎn)移灶。
將腫瘤細(xì)胞直接注射至原器官，所營(yíng)造的腫瘤微環(huán)境更接近于人體。
適用于神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤如脊索瘤、腦膠質(zhì)瘤等；前列腺癌、卵巢癌等的轉(zhuǎn)移研究。
將腫瘤細(xì)胞注射在脾臟后通過(guò)血液循環(huán)轉(zhuǎn)移到肝臟。
腫瘤細(xì)胞經(jīng)過(guò)左心室注射進(jìn)入小鼠體循環(huán)，經(jīng)過(guò)一系列過(guò)程，最終造成不同器官的轉(zhuǎn)移。
小愛(ài)以裸鼠皮下移植瘤模型的建立為例，具體實(shí)驗(yàn)步驟如下：
1）BALB/c nude裸鼠，4周齡，體重（15±2）g，雌雄各3只；
2）取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的熒光素酶陽(yáng)性克隆細(xì)胞，用PBS重懸為55×107/mL 懸液，每只裸鼠左右背側(cè)近腋部皮下接種100μL，共接種6只；
3）接種后第5天采用活體成像系統(tǒng)檢測(cè)信號(hào)強(qiáng)度。以后每5天觀察一次，連續(xù)觀察30天；
4）觀察前按150mg/kg體重的量腹腔注射底物D-熒光素(abs42017256)，10分鐘后，腹腔注射3%戊巴比妥鈉溶液，進(jìn)行活體成像觀察皮下腫瘤的生長(zhǎng)情況，定量分析各時(shí)間點(diǎn)的熒光值，繪制腫瘤皮下生長(zhǎng)曲線。
5、病理形態(tài)學(xué)觀察
病理形態(tài)學(xué)觀察常見(jiàn)的染色方式有HE、IF、IHC、mIHC等，染色原理及作用如表3，可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求選擇合適的方法進(jìn)行染色分析。值得注意的是，隨著科學(xué)家對(duì)疾病的深入探究，越來(lái)越多的科研學(xué)者更傾向于mIHC染色技術(shù)，而且發(fā)表的文章影響因子相對(duì)較高。
動(dòng)物活體成像觀察結(jié)束后，脫頸處死小鼠，取腫瘤組織，制成石蠟切片，切片厚度為3μm，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)的操作步驟經(jīng)染色后觀察組織細(xì)胞的病理形態(tài)。
表3 HE、IF、IHC、mIHC染色方法的區(qū)別
蘇木精為堿性染液，主要使細(xì)胞核內(nèi)的染色質(zhì)與胞質(zhì)內(nèi)的核酸著紫藍(lán)色；伊紅為酸性染料，主要使細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞外基質(zhì)中的成分著紅色。
可顯示組織正常與病變的一般形態(tài)結(jié)構(gòu)
抗原與抗體特異性結(jié)合，將熒光素標(biāo)記在抗體或抗原上，然后與其對(duì)應(yīng)的抗原或抗體結(jié)合。
檢測(cè)組織中蛋白以及特異性細(xì)胞的表達(dá)分布。
抗原與抗體特異性結(jié)合，通過(guò)化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記抗體的顯色劑（熒光素、酶、金屬離子和同位素）顯色。
確定組織細(xì)胞內(nèi)抗原，對(duì)其進(jìn)行定位、定性及相對(duì)定量。
TSA酪酰胺信號(hào)放大技術(shù)&抗原與抗體特異性結(jié)合，可標(biāo)記多個(gè)靶點(diǎn)（4~7種顏色）。
對(duì)靶蛋白或核酸進(jìn)行高密度原位標(biāo)記，使檢測(cè)信號(hào)幾何級(jí)放大。
（注：本文來(lái)源于文獻(xiàn)總結(jié)，僅供參考）
活體動(dòng)物光學(xué)成像技術(shù)讓研究人員能夠觀察活體動(dòng)物體內(nèi)的基因表達(dá)和細(xì)胞活動(dòng)，是將分子及細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)從體外研究發(fā)展到活體動(dòng)物體內(nèi)的強(qiáng)有力手段，該技術(shù)推進(jìn)了人們對(duì)各種生命活動(dòng)、疾病過(guò)程的深入認(rèn)識(shí)，正在被越來(lái)越廣泛地應(yīng)用于生物學(xué)及醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域。
動(dòng)物成像熒光染料
細(xì)胞處理相關(guān)試劑
細(xì)胞轉(zhuǎn)染相關(guān)試劑
G-418溶液（穩(wěn)定轉(zhuǎn)染最常用的抗性篩選試劑）
滅瘟素溶液（篩選攜帶bsr/BSD基因的轉(zhuǎn)染細(xì)胞）
質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染試劑盒（貼壁細(xì)胞）
轉(zhuǎn)染專(zhuān)用減血清培養(yǎng)基
組織染色相關(guān)試劑
腫瘤細(xì)胞抑制劑
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WB相關(guān)：ECL發(fā)光液、預(yù)染marker、預(yù)制膠；IHC相關(guān)：二抗試劑盒、組化筆；IP/CoIP試劑盒；激動(dòng)劑/抑制劑；血清、BSA、蛋白酶K、CTB、TTX、CEE；凋亡試劑盒；呼吸爆發(fā)試劑盒；ELISA試劑盒；重組蛋白；抗體: 二抗、標(biāo)簽抗體、對(duì)照抗體；定制服務(wù)(抗體/多肽/蛋白/標(biāo)記/檢測(cè))...
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