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小鼠肝細胞CYP450酶的含量測定

2020/10/18 17:56:53

背景及概述[1]

細胞色素P450(cytochromeP450,CYP450)是主要分布于肝微粒體的藥物主要代謝酶,參與脂肪酸、類花生四烯酸等多種內(nèi)源性物質(zhì)及藥物、毒物、致癌物、前致癌物等外源性化合物的代謝,其主要包括CYP1A2、CYP2A6、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1、CYP3A4、CYP3A5等,參與70%~80%臨床常用藥物的代謝。CYP450含量和活性影響藥物在體內(nèi)的代謝消除,其個體差異是導(dǎo)致藥物效應(yīng)差異的主要原因。體內(nèi)研究多通過CYP450探針?biāo)幬锏捏w內(nèi)藥動學(xué)來反映代謝情況,即將藥動學(xué)的個體差異歸因于藥物代謝差異,如CYP450基因多態(tài)性影響藥物代謝的結(jié)論多由此獲得。但體內(nèi)藥動學(xué)除受代謝影響外,亦受吸收、分布和排泄過程的影響。體外研究多停留在肝微粒體、肝細胞、重組酶等代謝體系中。由于標(biāo)本數(shù)量所限,肝微粒體研究難以涉及CYP450代謝活性的個體差異及影響因素,重組酶難以反映肝臟的實際狀況。

含量測定[1]

小鼠CYP450酶含量的測定:CYP450為血紅素蛋白,其還原型與CO結(jié)合后,在波長450nm處出現(xiàn)吸收峰,故可通過測定溶液的吸光度值,反映溶液中CYP450酶的含量。實驗步驟如下:

1. 分組:先將小鼠逐一稱重,按照體重由小到大(或由大到小)排序。根據(jù)簡化隨機原則將小鼠分為3組(甲、乙、丙),每組3只。

2. 腹腔注射給藥 甲組為0.75%苯巴比妥鈉溶液,乙組為0.002%放線菌素D溶液,丙組為生理鹽水。每組小鼠均連續(xù)給藥3天。

3. 制備肝勻漿 小鼠處死,取出肝臟,注意勿破壞膽囊。稱重后,將肝組織置于玻璃勻漿器中,加入預(yù)冷后的0.25mol/L蔗糖液(0.5ml/100mg肝組織),冰浴下研磨至淡粉色勻漿。然后4攝氏度下10,000 g離心20 min后,留取上清液。

4. 小鼠肝細胞CYP450酶含量的測定 取離心后上清液1ml,加入預(yù)冷后的0.05mol/L Tris-HCl緩沖液9ml,充分混勻。冰浴下通CO氣,1~2氣泡/s,通氣2min。將通氣完畢的溶液分為兩半,分別置于兩個試管中:其一作為測定吸光度時的參照杯,另一加入連二亞硫酸鈉5mg,充分混勻,即為待測樣品杯。測定并記錄樣品杯在450nm和490nm波長下的吸光度值(表23-4)。

5. 計算小鼠肝細胞CYP450酶含量

根據(jù)公式A = E·C·L,其中A:吸光度;E:490nm到450nm波長的示差光譜消光系數(shù),本實驗中E = 104L/cm·mmol;C:CYP450濃度;L:比色杯厚度(光路長度),本實驗中比色杯為1cm。因此,得到CYP450(nmol/g肝臟)= [(A450 - A490) / E·L]×50000

6. 小鼠肝細胞CYP450酶的誘導(dǎo)和抑制

(1) CYP P450升高百分率:

[(苯巴比妥組-生理鹽水對照組) /生理鹽水對照組]×100%

(2) CYP P450降低百分率:

[(生理鹽水對照組-放線菌素D組) /生理鹽水對照組]×100%

主要參考資料

[1] 人肝人肝細胞CYP450酶含量與活性研究進展

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