背景[1-6]
Novex 10-20%Tris-Glycine Mini Gels,WedgeWell format,10-well是濃度10-20%聚丙烯酰胺凝膠，可將各種蛋白質(zhì)重復(fù)分離成具有兩倍負(fù)載能力的良好分辨的條帶。Novex Tris-Glycine Mini Gels基于傳統(tǒng)的Laemmli蛋白電泳，可以使用Laemmli樣品和運(yùn)行緩沖液。
Novex 10-20%Tris-Glycine Mini Gels,WedgeWell format,10-well不含SDS，可用于以天然或變性形式運(yùn)行蛋白質(zhì)。對(duì)于變性蛋白質(zhì)，建議使用Novex Tris-Glycine SDS樣品緩沖液和Novex Tris-甘氨酸SDS運(yùn)行緩沖液。對(duì)于天然蛋白質(zhì)，建議使用Novex Tris-Glycine Native Sample Buffer和Novex Tris-Glycine Native Running Buffer。
Novex 10-20%Tris-Glycine Mini Gels具有創(chuàng)新的楔形孔，其樣品負(fù)載量比其他1.0 mm厚的凝膠多兩倍。楔形井也有較大的開(kāi)口，使樣品裝載更容易。為了將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上，建議在使用Invitrogen Mini Blot模塊進(jìn)行傳統(tǒng)濕轉(zhuǎn)移時(shí)使用Novex Tris-Glycine Transfer Buffer。也可以使用快速半干轉(zhuǎn)移進(jìn)行轉(zhuǎn)移使用iBlot 2凝膠轉(zhuǎn)移裝置進(jìn)行Invitrogen Power Blotter或快速干轉(zhuǎn)移。Novex Value Tris-Glycine Mini Gels可滿(mǎn)足的蛋白質(zhì)分離需求提供價(jià)格和性能的完美平衡。Novex Value Tris-甘氨酸聚丙烯酰胺凝膠以基于傳統(tǒng)Laemmli蛋白電泳的經(jīng)濟(jì)型凝膠提供良好的蛋白質(zhì)分離和分離度。每個(gè)盒子包含20個(gè)凝膠。
Novex Value凝膠的特點(diǎn)包括：
•卓越的價(jià)值和性能平衡-非常適合定性分析（例如，篩選，蛋白質(zhì)純化驗(yàn)證）
•快速運(yùn)行條件-在不到60分鐘的時(shí)間內(nèi)使用恒定電壓分離蛋白質(zhì)
•天然和天然的選項(xiàng)變性蛋白質(zhì)分析
應(yīng)用[7][8]
用于新型抗氧化蛋白PAMM及其在破骨細(xì)胞分化和雌激素缺乏所致骨質(zhì)疏松中的作用研究。
破骨細(xì)胞的形成和分化是機(jī)體維持骨穩(wěn)態(tài)的重要環(huán)節(jié),也是骨質(zhì)疏松等病理過(guò)程發(fā)生的關(guān)鍵因素。研究證明,活性氧(reactive oxygen species,RO S)在破骨細(xì)胞分化和骨代謝中具有重要作用。因此,進(jìn)一步研究闡明破骨細(xì)胞中的氧化還原調(diào)節(jié)及抗氧化防御系統(tǒng)及其在骨質(zhì)疏松中的作用對(duì)骨質(zhì)疏松等骨骼疾病防治,發(fā)展骨代謝疾病治療的新策略新方法并研究開(kāi)發(fā)以ROS為靶點(diǎn)的抗氧化治療藥物具有重要意義,已成為目前國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)和重要的研究方向。
我們?cè)谄乒羌?xì)胞中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)過(guò)氧化物酶-2(Peroxiredoxin-2,PRX-2)家族的新成員并將其命名為“巨噬細(xì)胞集落刺激因子刺激的單核細(xì)胞中活化的過(guò)氧化物酶類(lèi)分子(PRX-like 2 Activated in M-CSF stimulated Monocytes,PAMM)",其序列與PRXs相類(lèi)似且都含有許多氧化還原酶的共同結(jié)構(gòu)特征——CXXC結(jié)構(gòu),表明PAMM可能是一種具有氧化還原活性的蛋白分子。因ROS在破骨細(xì)胞分化和骨代謝中的重要意義,我們推測(cè)PAMM可能在破骨細(xì)胞分化及骨質(zhì)疏松中發(fā)揮重要作用。
因此,本研究主要從四個(gè)方面展開(kāi)對(duì)PAMM的系統(tǒng)研究闡明：
(1)PAMM分子的主要特性及其表達(dá)；
(2)PAMM在RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化中的作用；
(3)PAMM的抗氧化活性；
(4)PAMM在雌激素缺失所致骨質(zhì)疏松的作用及PAMM在雌激素的骨保護(hù)效應(yīng)中的作用,旨在揭示PAMM是一個(gè)能調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞分化的氧化還原調(diào)節(jié)蛋白,為骨質(zhì)疏松等骨骼疾病防治,發(fā)展骨代謝疾病治療的新策略和新方法和研發(fā)以ROS為靶點(diǎn)的抗氧化治療藥物提供干預(yù)作用的新的靶分子。
方法：
(1)PAMM分子的發(fā)現(xiàn)及其主要特性的研究：使用微陣列雜交(Microarray hybridization)技術(shù)對(duì)RANKL刺激的RAW264.7細(xì)胞以及M-CSF+RANKL刺激的正常小鼠骨髓單核細(xì)胞(BMM)進(jìn)行全基因組表達(dá)進(jìn)行篩選,發(fā)現(xiàn)并命名了PAMM,根據(jù)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)初步確定其抗氧化功能；獲取小鼠主要組織器官蛋白提取物,Western Blot分析PAMM在各組織器官中的表達(dá)；轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞’Western Blot檢測(cè)上清液中PAMM的表達(dá)；檢測(cè)在破骨細(xì)胞分化過(guò)程中PAMM mRNA(Real Time PCR)和蛋白(免疫熒光和免疫組織化學(xué)染色)的表達(dá),以及PAMM在Csf-1突變tl/tl大鼠補(bǔ)充M-CSF前后骨髓細(xì)胞中的表達(dá)。
(2)PAMM對(duì)破骨細(xì)胞分化的影響：以RAW264.7細(xì)胞為基礎(chǔ),建立PAMM穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系PAMM#1和PAMM#2,TRAP染色檢測(cè)PAMM高表達(dá)對(duì)RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化的影響,并檢測(cè)在補(bǔ)充H2O2后對(duì)破骨細(xì)胞分化的影響；Western Blot檢測(cè)PAMM穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞分化過(guò)程中NF-κB和c-Jun活性的變化；構(gòu)建PAMM突變質(zhì)粒C85G和C88G并轉(zhuǎn)染細(xì)胞檢測(cè)其對(duì)破骨細(xì)胞分化的影響,確定此過(guò)程中PAMM分子中CXXC組件的重要作用。
參考文獻(xiàn)
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