背景[1-6]
Novex 10%Tris-Glycine Mini Gels,WedgeWell format,12-well是濃度10%聚丙烯酰胺凝膠，可將各種蛋白質(zhì)重復(fù)分離成具有兩倍負載能力的良好分辨的條帶。Novex Tris-Glycine Mini Gels基于傳統(tǒng)的Laemmli蛋白電泳，可以使用Laemmli樣品和運行緩沖液。
Novex 10%Tris-Glycine Mini Gels,WedgeWell format具有6％至18％的各種固定濃度，以及4-12％，4-20％，8-16％和10-20％范圍的梯度。您可以從我們的許多井格式中進行選擇，包括10孔，12孔和15孔以及不同的包裝尺寸。
Novex 10%Tris-Glycine Mini Gels,WedgeWell format,不含SDS，可用于以天然或變性形式運行蛋白質(zhì)。對于變性蛋白質(zhì)，建議使用Novex Tris-甘氨酸SDS樣品緩沖液和Novex Tris-甘氨酸SDS運行緩沖液。對于天然蛋白質(zhì)，建議使用Novex Tris-Glycine Native Sample Buffer和Novex Tris-Glycine Native Running Buffer。Novex 10%Tris-Glycine Mini Gels具有創(chuàng)新的楔形孔，其樣品負載量比其他1.0 mm厚的凝膠多兩倍。楔形井也有較大的開口，使樣品裝載更容易。
為了將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上，建議在使用Invitrogen Mini Blot模塊進行傳統(tǒng)濕轉(zhuǎn)移時使用Novex Tris-Glycine Transfer Buffer。也可以使用快速半干轉(zhuǎn)移進行轉(zhuǎn)移使用iBlot 2凝膠轉(zhuǎn)移裝置進行Invitrogen Power Blotter或快速干轉(zhuǎn)移。經(jīng)過PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜）上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達的蛋白成分。該技術(shù)也廣泛應(yīng)用于檢測蛋白水平的表達。
應(yīng)用[7][8]
用于重組ADAMTS13對腦出血后腦損傷和腦水腫的作用機制研究。
血管性血友病因子(von Willebrand factor vWF)是一種結(jié)構(gòu)復(fù)雜的糖蛋白,在凝血和血栓中起重要作用,另外在炎癥反應(yīng)系統(tǒng)中VWF作為炎癥介質(zhì)能夠通過促進炎癥細胞的粘附、聚集進而促進炎癥反應(yīng)。有文獻報道VWF基因敲除能夠減少腦缺血后腦梗死體積。另外基礎(chǔ)和臨床研究表明蛛網(wǎng)膜下腔出血后血液中的vWF表達明顯上調(diào),vEF參與介導(dǎo)蛛網(wǎng)膜下腔出血后腦梗死和血管痙攣的發(fā)生,vWF高表達會導(dǎo)致腦出血病人預(yù)后不良。
ADAMTS13是vWF切割酶,vWF是目前已知ADAMTS13的唯一底物,ADAMTS13通過切割超聚化、功能超強的vWF使之成為分子量較小、活性較低的多肽,減少血栓形成和炎癥反應(yīng),減少腦缺血和蛛網(wǎng)膜下腔出血后神經(jīng)功能損傷。采用MCAO和ICH兩種腦中風(fēng)模型,檢測這兩種動物模型對血漿vWF表達量的影響,并進一步探討vWF切割酶rADAMTS13對tPA引起的急性腦中風(fēng)后溶栓性腦出血和腦出血后腦損傷和腦水腫的影響。
實驗方法：課題整體分成兩個部分,部分：重組ADAMTS13對腦出血后腦損傷和腦水腫的作用機制研究；第二部分：重組ADAMTS13通過vWF減少腦缺血后tPA引起的腦出血。
部分實驗方法：
1.本實驗采用二次注血法在小鼠紋狀體中注入30μL自體血構(gòu)建小鼠腦出血模型。
2.用ELISA方法測定腦出血24h后血液中vWF水平變化情況。
3.用H&E染色法測定腦出血72h后腦損傷體積。
4用干濕重法測定腦出血72h后腦組織含水量。
5.用fluoro-jade B染色法檢測出血24h后血腫周邊神經(jīng)元變性情況。
6.注射Evans blue觀察腦出血24h后血腦屏障通透。
7.用ELISA檢測腦出血24h后IL-6表達情況。
8.用MPO活性測定法測定MPO活性
9.用免疫熒光技術(shù)測定腦出血24h后中性粒細胞浸潤、小膠質(zhì)細胞激活情況。
10.用Western Blot測定腦出血24h后ICAM-1,VCAM-1表達情況。
11.用明膠酶譜法測定腦出血后24h后MMP-9的活性。
實驗方法：
1.本實驗采用小鼠單側(cè)大腦中動脈阻塞的方法(MCAO)建立局灶性缺血/再灌注模型。
2.首先我們使用ELISA法檢測缺血造模后給予tPA導(dǎo)致的小鼠血漿vWF水平變化情況。
3.用紫外分光光度計測定不同處理組(vehicle、tPA、vWF、tPA+vWF、tPA+rATS、tPA+vWF+rATS)的腦出血量。
4.采用明膠酶譜法分析不同處理組(sham、vehicle、tPA、rATS+tPA)MMP-9活性變化情況.
5.應(yīng)用Western Blot方法檢測不同處理組(sham、vehicle、tPA、rATS+tPA)細胞核內(nèi)NF-κB表達情況
6.用Western Blot方法測定不同處理組(sham、vehicle、tPA、rATS+tPA)VEGF表達水平,利用免疫熒光法測定不同處理組(vehicle、tPA、rATS+tPA)VEGF與CD31+的共標(biāo)數(shù)量。
7.利用Western Blot技術(shù)測定不同處理組(sham、vehicle、tPA、rATS+tPA)RhoA激活的水平,通過免疫熒光計數(shù)不同組(vehicle、tPA、rATS+tPA)RhoA-GFAP共標(biāo)細胞的數(shù)量。
參考文獻
[1]Effect of ADAMTS‐13 on cerebrovascular microthrombosis and neuronal injury after experimental subarachnoid hemorrhage[J].C.Muroi,M.Fujioka,K.Mishima,K.Irie,Y.Fujimura,T.Nakano,J.Fandino,E.Keller,K.Iwasaki,M.Fujiwara.J Thromb Haemost.2014(4)
[2]NLRP3 inflammasome contributes to inflammation after intracerebral hemorrhage[J].Qingyi Ma,Sheng Chen,Qin Hu,Hua Feng,John H.Zhang,Jiping Tang.Ann Neurol..2014(2)
[3]von Willebrand Factor:Form for Function[J].Andrew Yee,Colin Kretz.Semin Thromb Hemost.2013
[4]Inflammation in intracerebral hemorrhage:From mechanisms to clinical translation[J].Yu Zhou,Yanchun Wang,Jian Wang,R.Anne Stetler,Qing-Wu Yang.Progress in Neurobiology.2013
[5]Simvastatin Increases ADAMTS13 Expression in Podocytes[J].Lei Shen,Guoyuan Lu,Ningzheng Dong,Zhenni Ma,Changgeng Ruan.Thrombosis Research.2013(1)
[6]Variability in platelet‐and collagen‐binding defects in type 2M von Willebrand disease[J].D.M.Larsen,S.L.Haberichter,J.C.Gill,A.D.Shapiro,V.H.Flood.Haemophilia.2013(4)
[7]Endothelial Von Willebrand Factor Promotes Blood–Brain Barrier Flexibility and Provides Protection From Hypoxia and Seizures in Mice[J].Georgette L.Suidan,Alexander Brill,Simon F.De Meyer,Jaymie R.Voorhees,Stephen M.Cifuni,Jessica E.Cabral,Denisa D.Wagner.Arteriosclerosis,Thrombosis,and Vascular Biology.2013(9)
[8]蔡萍.重組ADAMTS13對腦出血后腦損傷和腦水腫的作用機制研究[D].復(fù)旦大學(xué),2014.