背景[1-6]
mRNA提取試劑盒用于從細(xì)胞、組織、新鮮血液和病毒中提取200 bp及以下的small RNA，用LB10裂解樣品后，加入氯仿，溶液分為無色水相和粉紅色有機(jī)相，RNA在水相中；用RNA硅膠膜離心柱特異地吸附水相中的大分子量RNA(28S rRNA,18S rRNA,mRNA），流出液中的small RNA用miRNA硅膠膜離心柱特異地吸附。與其它miRNA提取方法相比，該試劑盒裂解能力強(qiáng)、提取量高、專一性強(qiáng)，應(yīng)用范圍廣。
mRNA提取試劑盒包括一套用于固、液相分離的分離裝置；所述分離裝置中至少包含一層纖維素固相載體；該試劑盒還包括下述所有成份：至少有一管為細(xì)胞或組織裂解液；至少有一管為生物素化Oligo(dT)探針；至少有一管為結(jié)合緩沖液；至少有一管為洗脫緩沖液。該試劑盒操作簡(jiǎn)便、快速、高效，適合用于生物樣品中mRNA的分離提取。
其主要特征在于分離裝置中采用纖維素為固相載體，利用融合蛋白CBD-SA作為生物橋聯(lián)劑，以生物特異性偶聯(lián)法代替?zhèn)鹘y(tǒng)的物理吸附法和化學(xué)鍵合法活化纖維素固相載體，活化后的固相載體能夠高效率的結(jié)合生物素化的試劑，可用于蛋白或核酸的分離。構(gòu)建cDNA文庫(kù)、蛋白質(zhì)的體外翻譯和RT-PCR方法檢測(cè)稀有的mRNA等研究常常需要從總RNA中分離mRNA，mRNA只占總RNA的1%左右，但由于帶poly(A)尾巴，所以可以通過與Oligo(dT)的親和結(jié)合而與其RNA（如rRNA、tRNA等）分離開。
使用方法：將0.5 mL結(jié)合液加入到一管裝有1 mg Oligo(dT)纖維素的離心管中，放置5分鐘后離心吸棄上清后待用。將制備的總RNA 100μL加熱到65℃5分鐘后加入等體積的結(jié)合液，轉(zhuǎn)移到裝有Oligo(dT)纖維素的離心管中，顛倒混勻數(shù)次，離心后將上清轉(zhuǎn)移到一個(gè)離心管中。用0.5 mL結(jié)合液，混勻后4℃200 g離心5分鐘，小心棄上清。重復(fù)上步洗3-5次，用RNase-free水洗脫mRNA，用微量核酸沉淀劑沉淀回收mRNA。
mRNA提取試劑盒具有下列特點(diǎn)：
1.直接從總RNA中提取mRNA，即開即用，非常方便。
2.處理量大，一次可以處理10μg總RNA。
3.操作簡(jiǎn)單，只需要離心就可以完成，免去了灌柱、洗柱等麻煩。
4.得到的mRNA可以直接用于構(gòu)建cDNA文庫(kù)、蛋白質(zhì)的體外翻譯和RT-PCR。
應(yīng)用[7][8]
mRNA提取試劑盒可用于游離mRNA的提取實(shí)驗(yàn)：
在基于存在形式的人精漿游離mRNA和microRNA提取實(shí)驗(yàn)中由于精漿小體直徑大部分在0.10μm以上，本實(shí)驗(yàn)擬采用0.10μm濾膜對(duì)精漿標(biāo)本微過濾（microfiltration,MF）截留大部分精漿小體，用于提取cfs-mRNA，檢測(cè)這種基于存在形式的提取方法的提取量，同時(shí)也是對(duì)cfs-mRNA的存在形式進(jìn)行證實(shí)性研究。
收集精液參數(shù)正常的男性精液標(biāo)本，用0.10μm濾膜過濾后用TrizolLSReagent提取cfs-mRNA，通過熒光定量RT-PCR，擴(kuò)增管家基因β-actin（ACTB）、睪丸組織特異基因DDX4、PRM2、附睪特異性表達(dá)基因WFDC9、前列腺特異基因TGM4、精囊腺特異基因SERPINA5，與不過濾直接應(yīng)用TrizolLSReagent提取cfs-mRNA比較，分析0.10μm濾膜對(duì)cfs-mRNA提取含量的影響。
結(jié)果：將正常男性精漿標(biāo)本通過0.10μm濾膜后再采用TrizolLSReagent提取cfs-mRNA，與未過濾提取的mRNA比較，分別有93.9%±15.7%（Mean±SE）ACTB、99.1%±12.5%DDX4、76.9%±18.5%PRM2、88.1%±29.6%WFDC9、150.2±73.6%TGM4、98.6%±17.8%SERPINA5被提取，各基因水平均無明顯降低（P>0.05,n=6,Paird-Samplest-test)。說明大部分含cfs-mRNA的精漿小體被0.1μm濾膜截留下來，濾膜上精漿小體內(nèi)cfs-mRNA足以穩(wěn)定被檢測(cè)出。
結(jié)論：利用0.10μm濾膜對(duì)精漿小體進(jìn)行富集，進(jìn)而再提取cfs-mRNA，這種基于存在形式的提取方法，不會(huì)對(duì)cfs-mRNA量產(chǎn)生明顯降低，因此可有效的提取cfs-mRNA。且本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與前期課題組對(duì)通過精漿小體的獲取及過濾實(shí)驗(yàn)等結(jié)果一致，表明大部分精漿小體不能通過0.10μm濾膜，同時(shí)證實(shí)cfs-mRNA主要被包裹在精漿小體中。析經(jīng)濾膜過濾后所提取的cfs-mRNA的純度和DNA污染等。
方法：分別通過未過濾直接用TrizolLSReagent提取方法，和微過濾（microfiltration,MF,直徑0.1μm）后TrizolLSReagent對(duì)留于濾膜上的精漿小體進(jìn)行裂解提取的方法，提取cfs-mRNA。通過分光光度計(jì)測(cè)定兩種方法提取的mRNA純度（OD260/280）；通過毛細(xì)血管電泳對(duì)所提取的RNA片段分布進(jìn)行分析；熒光定量PCR擴(kuò)增DDX4，定量檢測(cè)兩種方法提取的cfs-mRNA中基因組DNA的殘留量。提取濾膜上及濾液中的DNA，熒光RT-PCR定量檢測(cè)DNA殘留量，并與精漿DNA總量進(jìn)行比較。
參考文獻(xiàn)
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