背景[1-6]
RNA長(zhǎng)效保存液是一種能高效抑制RNase活性的新型小分子混合物,用于防止RNase對(duì)RNA的降解作用。組織RNA長(zhǎng)效保護(hù)液從新鮮組織細(xì)胞中提取RNA時(shí)，由于各種原因若不能馬上處理樣品，即使－70℃保存樣品中的RNA也不穩(wěn)定容易降解，而液氮保存既昂貴又不方便。RNA保護(hù)液是一種無毒的樣品儲(chǔ)存液，能迅速滲入新鮮組織細(xì)胞的胞漿迅速而強(qiáng)烈滅活生物樣品中的RNA酶，抑制RNA降解。
標(biāo)本在4℃或室溫長(zhǎng)時(shí)間保存，其中的RNA不會(huì)降解，免去使用液氮或超低溫冰箱的不便，從而有效地解決了樣品保存及運(yùn)輸?shù)膯栴}。隨后可采用當(dāng)今世界上各種常見的RNA抽提試劑如RNAtrip、TRIzol或用戶自備試劑提取樣品RNA。
組織RNA長(zhǎng)效保護(hù)液使用范圍：
1.生物樣品已采集完畢，但由不可預(yù)測(cè)原因不能立即進(jìn)行RNA提取。
2.異地生物標(biāo)本保存和運(yùn)輸。如野外采集動(dòng)植物標(biāo)本，異地運(yùn)輸或郵寄標(biāo)本等。
3.沒有低溫條件或低溫設(shè)備不可用。如冰箱故障意外停電等。
4.RNase含量特別豐富的組織如胰腺或脾臟，預(yù)先用RNA保護(hù)液進(jìn)行預(yù)處理，可以獲得很好的結(jié)果。
5.珍貴樣品，取出部分RNA保護(hù)液處理過的樣品提取RNA，剩余樣品可繼續(xù)凍存于保護(hù)液中?？煞磸?fù)凍融并多次取樣20次以上。
6.RNA表達(dá)分析，不同實(shí)驗(yàn)RNA表達(dá)的時(shí)序變化可立即被RNA保護(hù)液固定，減少樣品誤差。
適用：新鮮生物組織和細(xì)胞，如動(dòng)物組織、植物組織、臨床標(biāo)本、胚胎、真核細(xì)胞、血液、細(xì)菌、酵母菌，病毒等。但不能用于已經(jīng)保存冷凍組織和凍融后的組織。
產(chǎn)品特點(diǎn)：
1.高效抑制RNase，保存在RNAsaver中的RNA可以在抵抗100 ng/mL的RNase A的降解作用達(dá)36小時(shí)，
效果比人胎盤RNase抑制蛋白和RVC更有效。
2.耐高溫,100℃保溫30分鐘后活性不受任何影響。
3.抗氧化，不需要DTT。
4.有效pH范圍廣。
5.產(chǎn)品為淡紅色液體，可以-20℃保存兩年。
RNA長(zhǎng)效保存液將直接用于溶解RNA沉淀(跟使用RNase-free水一樣)，然后放置在適當(dāng)溫度下保存(一般在-20℃)。保存在RNApreserve中的RNA可以直接電泳，不影響Northern雜交。但由于RNA保存液會(huì)抑制后續(xù)酶反應(yīng)，所以如果RNA要用于RT-PCR等反應(yīng)，需要預(yù)先用LiCl沉淀去除RNA保存液(將1/3倍體積的LiCl加入溶液中，4℃12000～15000g離心20-30分鐘，棄上清，用75%乙醇洗一次既得RNA沉淀)。
應(yīng)用[7][8]
RNA長(zhǎng)效保存液可用于RNA及RNA樣本的長(zhǎng)期保存：
RNA固定劑、固定時(shí)間及溫度對(duì)RNA病毒感染組織總RNA的完整性、得率及病毒RNA擴(kuò)增的影響。以及固定劑和固定時(shí)間對(duì)石蠟包埋組織中RNA降解和標(biāo)本病理形態(tài)學(xué)的影響。方法：取漢坦病毒76—118株接種乳鼠的感染組織，以沉淀脫水類固定劑100％甲醇、75％乙醇、100％丙酮以及醛類固定劑4％的多聚甲醛磷酸緩沖液(4％PFA)、10％福爾馬林共五種固定劑，分別在4℃和室溫下固定病毒感染組織6h、12h、24h和48h后，對(duì)固定后標(biāo)本進(jìn)行如下檢測(cè)或處理：
1、從固定6h～48h后的標(biāo)本中直接提取組織總RNA，用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA完整性；以分光光度計(jì)測(cè)吸光度計(jì)算組織總RNA得率；用巢式RT—PCR擴(kuò)增病毒RNA序列，電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物并行灰度掃描。對(duì)RNA得率及PCR產(chǎn)物電泳所測(cè)灰度值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。2、將固定后的病毒感染組織標(biāo)本進(jìn)行石蠟包埋長(zhǎng)期保存。對(duì)石蠟包埋組織切片后HE染色，鏡下觀察各種固定劑對(duì)組織病理形態(tài)學(xué)的影響。
從長(zhǎng)期保存的各種方式固定后石蠟包埋組織中以RT—PCR擴(kuò)增出不同片段長(zhǎng)度的病毒RNA及β-actin RNA序列，以獲得產(chǎn)物長(zhǎng)度或?qū)﹂L(zhǎng)片段擴(kuò)增的可重復(fù)性及假陰性的多少，來反映各種固定方式對(duì)病毒RNA和細(xì)胞總RNA降解的影響。結(jié)果：
1、病理切片結(jié)果顯示，經(jīng)10％福爾馬林和4％PFA固定的石蠟切片，組織結(jié)構(gòu)完整清晰。其他三種沉淀脫水類固定劑固定后組織有不同程度收縮，但不影響組織病理形態(tài)學(xué)檢測(cè)，其中甲醇固定的收縮程度最小。
2、固定標(biāo)本直接提取RNA結(jié)果，(1)RNA完整性：與立即冰凍或新鮮組織比較，100％甲醇固定24h，RNA完整性損傷不明顯；75％乙醇、100％丙酮固定12h后RNA開始出現(xiàn)損傷帶，24h出現(xiàn)明顯的損傷；而10％福爾馬林、4％PFA固定6h就開始出現(xiàn)明顯的損傷，固定24 h幾乎很難看清RNA條帶。
(2)RNA得率析因分析結(jié)果顯示，不同固定劑、固定時(shí)間、固定溫度下固定的組織中所提RNA的得率有顯著性差異(P＜0.01)，沉淀類固定劑固定后組織RNA得率明顯高于醛類固定劑(P＜0.01)；三種沉淀類固定劑之間差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義伊>0.01);4%PFA高于10%福爾馬林(P<0.01)。固定劑、固定時(shí)間和固定溫度之間有顯著性交互作用(P<0.01)，4℃甲醇固定6h的RNA得率最高，10%福爾馬林在室溫下固定48h得率最低。
參考文獻(xiàn)
[1]Rapid differentiation between Hantaan and Seoul viruses by polymerase chain reaction and restriction enzyme analysis.Kim EC,Kim IS,Choi Y,et al.Journal of Medical Virology.1994
[2]Detection of HCV-RNA in paraffin-embedded liver biopsies from patients with autoimmune hepatitis.Savage K,Dhillon AP,Schmilovitz-Weiss H,et al.Journal of Hepatology.1995
[3]Epstein-Barr virus and human hepatocellular carcinoma.Shamim A,Huifeng L,Ramesh P,et al.Cancer Letters.2003
[4]Epstein-Barr virus and human hepatocellular carcinoma.Akhter S,Liu H,Prabhu R,et al.Cancer Letters.2003
[5]Relman.Detection and Identification of Previously Unrecognized Microbial Pathogens.David A.Emerging Infections.1998
[6]Relman.Detection and Identification of Previously Unrecognized Microbial Pathogens.David A.Emerging Infections.1998
[7]Differentiation between porcine epidemic diarrhea virus and transmissible gastroenreritis virus in formalin-fixed paraffin-embedded tissues by multiplex RT-nested PCR and comparison with in situ hybridization.Jung K,Kim J,Kim O,et al.Journal of Virology.2003
[8]賀莉萍.RNA病毒感染組織標(biāo)本保存方法探討[D].武漢大學(xué),2004.