背景^[1-7]

非酶DNA清除劑是一種使用破壁酶(Lyticase)消化去除酵母細胞壁，然后采用一種新型的酵母質(zhì)粒純化柱實現(xiàn)從酵母細胞中進行小量質(zhì)?？焖俪樘岬脑噭┖?。非酶DNA清除劑本實驗方法的基本原理是，在高鹽狀態(tài)下，硅膠膜專一性地吸附DNA；而在低鹽或水溶液狀態(tài)下，DNA被洗脫下來。此法簡便快捷，可在30分鐘內(nèi)同時提純二十多個樣品。

從3～5ml培養(yǎng)過夜的含高拷貝質(zhì)粒的菌液中可以獲得10～20μg高純度的質(zhì)粒DNA，用于酶切、轉(zhuǎn)化、DNA自動測序和手工測序等。用Trizol等方法提取的細胞總RNA樣品中經(jīng)常會含有基因組DNA污染，這些污染會影響下游的RT-PCR和Northern雜交等實驗。目前最常用的RNase-freeDNase處理方法因DNase中所含殘留的RNase能破壞RNA完整性而具有很大缺陷。開發(fā)的非酶DNA清除劑不但徹底避免了RNase-free DNase的這一缺陷，同時還具有操作快速，穩(wěn)定性好和性價比高等諸多優(yōu)點，完全可以替代價格昂貴的RNase-free DNase。

特點：

1無需酚氯仿抽提，無需酒精沉淀，12個樣品只需約1-1.5小時即可完成。

2試劑盒提供了破壁酶(Lyticase)，酵母收集后，加入Lyticase消化去除細胞壁，接著采用傳統(tǒng)堿裂法裂解細胞，然后將獲得的上清液轉(zhuǎn)移至結(jié)合柱結(jié)合DNA，經(jīng)過離心快速洗滌，最后用洗脫液洗脫出酵母質(zhì)粒DNA。

3由于采用了高濃度的破壁酶，無需再使用玻璃珠，可以避免因為玻璃珠的機械作用帶來的酵母基因組DNA污染。

非酶DNA清除劑純化柱可以結(jié)合的質(zhì)粒量的上限約為20微克。質(zhì)粒DNA的產(chǎn)量依賴于酵母攜帶質(zhì)粒的拷貝數(shù)，酵母菌株以及生長條件。通常酵母質(zhì)粒的拷貝數(shù)較低，1.5-5ml培養(yǎng)過夜的酵母抽提獲得的質(zhì)粒DNA量約為1-3微克左右。高拷貝酵母質(zhì)粒抽提時的得率會大大提高。抽提所得質(zhì)粒的量與酵母培養(yǎng)濃度、質(zhì)?？截悢?shù)、酵母品系等因素有關(guān)。

應(yīng)用^[8][9]

非酶DNA清除劑可用于高純度RNA提取中的DNA的去除：

在擬南芥Flowering Locus T基因生物功能及其mRNA移動能力研究需要提取高純度的RNA。擬南芥開花誘導(dǎo)基因網(wǎng)絡(luò)主要是通過光周期途徑(photoperiod pathway)、春化途徑(vernalization PathWay)、自發(fā)途徑(autonomous pathway)和赤霉素途徑(GA pathway)等4個途徑進行的，有很多相關(guān)基因起作用，其中擬南芥FLOWERING LOCUS T(FT)基因在其成花信號基因網(wǎng)絡(luò)中起很重要的整合作用，在光周期誘導(dǎo)途徑中，擬南芥葉片中光受體與相關(guān)感光節(jié)律基因構(gòu)成的生物節(jié)律鐘感受光周期信號，調(diào)控CONSTANS(CO)基因節(jié)律表達，CO基因在合適光周期調(diào)控下，將開花信號傳導(dǎo)至FT基因，引起葉片中FT基因表達，F(xiàn)T基因表達產(chǎn)物、FT mRNA單獨或相互作用，經(jīng)韌皮部長距離運移到頂端分生組織，調(diào)節(jié)下游分生組織及花器官決定基因形成花芽開花。

FT基因在光周期及其它開花誘導(dǎo)途徑中起開花信號關(guān)鍵整合作用，也是現(xiàn)在已知在葉片中感受開花信號而長距離作用于頂端分生組織的基因。本試驗對擬南芥FT基因的研究取得了如下研究結(jié)果：采集16h長日照條件下始花期野生型擬南芥葉片為樣本，采用異硫氰酸胍法提取總RNA，利用RT-PCR法成功克隆得到擬南芥開花誘導(dǎo)遺傳網(wǎng)絡(luò)中關(guān)鍵的樞紐基因FLOWERING LOCUST(FT)，分析得到完整FT基因閱讀框序列，完整閱讀框架長度為528bp，經(jīng)與NCBI GeneBank數(shù)據(jù)庫比對序列完全正確。

參考文獻

[1]Export of FT Protein from Phloem Companion Cells Is Sufficient for Floral Induction in Arabidopsis[J] . Johannes Mathieu,Norman Warthmann,Frank Küttner,Markus Schmid.  Current Biology . 2007 (12)

[2]INTEGRATIVE PLANT BIOLOGY: Role of Phloem Long-Distance Macromolecular Trafficking[J] . Tony J. Lough,William J. Lucas.  Annual Review of Plant Biology . 2006

[3]Conservation and Divergence of FCA Function between Arabidopsis and Rice[J] . Jeong-Hwan Lee,Young-Sil Cho,Hoon-Seok Yoon,Mi Chung Suh,Jihyun Moon,Ilha Lee,Detlef Weigel,Choong-Hyo Yun,Jeong-Kook Kim.  Plant Molecular Biology . 2005 (6)

[4]The SOC1 MADS‐box gene integrates vernalization and gibberellin signals for flowering in Arabidopsis[J] . JihyunMoon,Sung‐SukSuh,HorimLee,Kyu‐RiChoi,Choo BongHong,Nam‐ChonPaek,Sang‐GuKim,IlhaLee.  The Plant Journal . 2003 (5)

[5]FY Is an RNA 3′ End-Processing Factor that Interacts with FCA to Control the Arabidopsis Floral Transition[J] . Gordon G Simpson,Paul P Dijkwel,Victor Quesada,Ian Henderson,Caroline Dean.  Cell . 2003 (6)

[6]Potato virus X: a model system for virus replication, movement and gene expression[J] . Jeffrey S.Batten,ShigeoYoshinari,CynthiaHemenway.  Molecular Plant Pathology . 2003 (2)

[7]The VERNALIZATION INDEPENDENCE 4 gene encodes a novel regulator of FLOWERING LOCUS C[J] . Hua Zhang,Steven Van Nocker.  The Plant Journal . 2002 (5)

[8]The VERNALIZATION 2 Gene Mediates the Epigenetic Regulation of Vernalization in Arabidopsis[J] . Anthony R. Gendall,Yaron Y. Levy,Allison Wilson,Caroline Dean.  Cell . 2001 (4)

[9]劉旭新. 擬南芥Flowering Locus T基因生物功能及其mRNA移動能力研究[D].西北農(nóng)林科技大學(xué),2008.