背景[1-7]
柱式DNA清除劑可用于細(xì)胞總RNA樣品中基因組DNA污染的去除。目前zui常用的RNase-free DNase處理方法因DNase中所含殘留的RNase能破壞RNA完整性而具有很大缺陷。柱式非酶DNA清除劑不但徹底避免了RNase-free DNase的這一缺陷。柱式DNA清除劑為非酶產(chǎn)品，可以常溫運(yùn)輸和4℃長期保存；而RNase-freeDNase的運(yùn)輸和長期保存必須在低溫進(jìn)行。
實(shí)驗(yàn)要點(diǎn)
1．CTAB溶液在低于15℃時(shí)會析出沉淀，因此在將其加入冷凍的植物材料中之前必須預(yù)熱。
2．在最適條件下，DNA—CTAB沉淀呈白色纖維狀，很容易一下子就從溶液中鉤出。不過，某些植物種的DNA沉淀中可能含有雜質(zhì)，特別是多糖，使DNA沉淀呈絮狀或膠狀，這種情況下可能需要稍事離心才能得到DNA.—CTAB沉淀。
3．飽和酚雖然可有效地使蛋白質(zhì)變性，但酚不能完全抑制RNA酶的活性,而且酚可以溶解含poLy(A)的mRNA。如果用苯酚和氯仿的混合液，可減輕這兩種現(xiàn)象，同時(shí)可加入適量的異戊醇（苯酚—氯仿—異戊醇=25:24:1），異戊醇的作用是消泡，并使蛋白質(zhì)層緊密，使水相和有機(jī)相分層較好。
細(xì)菌的培養(yǎng)和收集將含有質(zhì)粒pBS的DH5α菌種接種在LB固體培養(yǎng)基(含50μg/ml Amp)中,37℃培養(yǎng)12-24小時(shí)。用無菌牙簽挑取單菌落接種到5ml LB液體培養(yǎng)基(含50μg/ml Amp)中,37℃振蕩培養(yǎng)約12小時(shí)至對數(shù)生長后期。柱式DNA清除劑小量提取法對于從大量轉(zhuǎn)化子中制備少量部分純化的質(zhì)粒DNA十分有用。這些方法共同特點(diǎn)是簡便、快速，能同時(shí)處理大量試樣,所得DNA有一定純度,可滿足限制酶切割、電泳分析的需要。
注意事項(xiàng)：
1.對大腸桿菌可從固體培養(yǎng)基上挑取單個(gè)菌落直接進(jìn)行煮沸法提取質(zhì)粒DNA。
2.煮沸法中添加溶菌酶有一定限度,濃度高時(shí),細(xì)菌裂解效果反而不好。有時(shí)不同溶菌酶也能溶菌。
3.提取的質(zhì)粒DNA中會含有RNA,但RNA并不干擾進(jìn)一步實(shí)驗(yàn),如限制性內(nèi)切酶消化,亞克隆及連接反應(yīng)等。
應(yīng)用[8][9]
柱式DNA清除劑可用于血液、組織及細(xì)菌RNA提取實(shí)驗(yàn)中DNA污染的去除：
在苦瓜降血糖多肽-P差異表達(dá)方法的建立及其篩選應(yīng)用實(shí)驗(yàn)中需要去除基因組DNA?？喙献鳛橐环N常見的藥食兩用的植物,其降血糖活性早已得到廣泛的認(rèn)可并被動物實(shí)驗(yàn)和臨床實(shí)驗(yàn)所證實(shí)?？喙辖笛浅煞种饕譃樵碥蘸投嚯膬纱箢?其中降血糖多肽P早在20世紀(jì)九十年代已進(jìn)行了分離純化和藥效研究,課題組前期研究中首次獲得了降血糖多肽P的基因序列。
本課題主要研究目標(biāo)為：1在分子水平對不同苦瓜品種的降糖多肽P建立表達(dá)差異性研究系統(tǒng)；2根據(jù)建立的系統(tǒng)篩選優(yōu)質(zhì)的降血糖苦瓜品種。首先,為了獲得優(yōu)質(zhì)的RNA,以滿足后續(xù)不同苦瓜品種降血糖多肽-P表達(dá)研究,本文通過對RNA抽提方法的優(yōu)化,獲得了不同品種高質(zhì)量的苦瓜RNA；通過三種去除RNA中DNA殘留不同方法的比較,成功地確定了一種高效的去除RNA中微量DNA污染的方法；通過RNA逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng),在不同品種苦瓜中得到了含有多肽P序列的cDNA產(chǎn)物。
其次,利用實(shí)時(shí)定量PCR,建立篩選優(yōu)質(zhì)降血糖苦瓜品種的方法,需要選擇合適的苦瓜內(nèi)參基因。根據(jù)葫蘆科植物β-actin保守序列設(shè)計(jì)了引物,用該引物成功獲得了一段長為329bp,含88bp內(nèi)含子結(jié)構(gòu)的苦瓜β-actin基因序列；通過在形態(tài)差異較大、地域不同的苦瓜品種進(jìn)行表達(dá)穩(wěn)定性檢測,確定了該基因可作為實(shí)時(shí)定量PCR研究苦瓜多肽P表達(dá)的內(nèi)參基因；另外,通過NCBI數(shù)據(jù)庫查找,成功地獲得了苦瓜18S rRNA基因,并確定了其作為苦瓜內(nèi)參基因的可能性。
最后,將獲得的苦瓜p-actin內(nèi)參基因引物和多肽P特異性引物進(jìn)行溶解曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線分析,確保這些引物適合于實(shí)時(shí)熒光定量PCR的分析。選取八種外觀差異明顯,產(chǎn)地不同的苦瓜,以β-actin作為內(nèi)部參比對照,經(jīng)實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析,確定了具有高表達(dá)多肽P的純豐綠皮和H&V苦瓜品種。
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