背景^[1-6]

昆蟲基因組DNA提取試劑盒采用獨(dú)特的裂解液能夠有效除去多糖多酚等，能夠從昆蟲、軟體動物、節(jié)肢動物、蛔蟲等樣品中提取DNA，保存在在醇類的樣品也適用于本試劑盒的提取。一次操作可以處理小于50mg組織，樣品經(jīng)裂解液消化，氯仿分離除去大部分的多糖多酚，再經(jīng)分離柱進(jìn)一步純化，便可得到高純度的DNA。所得的DNA可以用于PCR，Southern雜交，酶切消化等實驗。昆蟲基因組DNA提取試劑盒專門為從昆蟲等低等非脊索動物，包括某些植物組織中提取基因組DNA而設(shè)計。該方法結(jié)合了CTAB裂解法和硅膠柱純化方式，能有效地去除各種色素，甲殼素，多糖等雜質(zhì)。

純化的DNA可直接用于PCR，Southern雜交，酶切等后續(xù)實驗。昆蟲組織(細(xì)胞)磨碎成粉末后，用CTAB裂解液裂解,氯仿抽提去除多聚糖等物質(zhì)后，異丙醇沉淀初步純化DNA，重新溶解DNA加入乙醇調(diào)節(jié)DNA與柱子的結(jié)合條件，過柱進(jìn)一步純化DNA，通過兩步快速地洗滌柱子以去除雜質(zhì)，最后用滅菌水或低鹽緩沖液溶解并洗脫出DNA。標(biāo)準(zhǔn)操作步驟：

如非指出，所有離心步驟均為使用臺式離心機(jī)在室溫下離心。

1.液氮充分研磨樣品。

2.收集研磨成粉末的50mg樣品，置于1.5ml離心管中。

3.加入350μl65℃預(yù)熱的緩沖液IL，并加入20μl蛋白酶K劇烈地漩渦振蕩，確保所有的組織團(tuán)都分散均勻。

4.65℃水浴20-30min。水浴期間顛倒樣品數(shù)次。

5.加入350μl氯仿，充分混勻，12,000 rpm(~13,400×g)離心5分鐘。

6.小心地把上清液吸至另一新的1.5ml離心管中。注意確保不要打散沉淀團(tuán)或把組織碎片也一起轉(zhuǎn)移。

7.加入4μl RNase A，渦旋混勻。室溫放置2min。

8.加入二分之一上清體積的緩沖液IB與等體積的無水乙醇，充分混勻。如：向300μl上清中加入150μl緩沖液IB與300μl無水乙醇。

9.把上述混勻的液體轉(zhuǎn)移到吸附柱上。10,000×g離心1 min以結(jié)合DNA，棄去濾出液體。純化柱容量為750μl,如果混合液大于750μl,請分兩次過柱。

10.將吸附柱重新套回收集管中，加入500μl緩沖液WB至柱子中，10,000×g離心1min,倒棄流出液；

11.將吸附柱重新套回收集管中，加入600μl DNA Wash Buffer至柱子中，10,000×g離心1min,倒棄流出液；

注意：DNA Wash Buffer使用前須按要求用無水乙醇稀釋。如果放入冰箱中，使用前須恢復(fù)到室溫。

12.再加入600μl DNA Wash Buffer至柱子中，8,000×g離心1min,棄去流出液；

13.將吸附柱重新套回2ml收集管中，轉(zhuǎn)速（>13000×g）離心空結(jié)合柱1min以干燥柱子的基質(zhì)；這一步對下面的洗脫步驟至關(guān)重要。

14.將柱子置于1.5ml滅菌離心管，加入50-150μl65℃預(yù)熱的洗脫緩沖液EB至柱子的膜中央。室溫靜置5min；

15. 室溫下，離心(>13000)1min，以洗脫DNA。保留含DNA的流出液。將DNA儲于-20℃。

DNA濃度及純度檢測：

基因組DNA片段的大小與樣品保存時間、操作過程中的剪切力等因素有關(guān)。提取的DNA片段可用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測濃度與純度?？膳渲?.8-1.0％瓊脂糖凝膠，使用λ/HindIII判斷基因組的大小，完整的基因組大小應(yīng)在23kb以上。使用分光光度計檢測時，OD260/OD280比值應(yīng)為1.7–1.9之間，如果洗脫時不使用洗脫緩沖液，而使用去離子水洗脫，比值可能偏低，但并不表明DNA純度不高。

應(yīng)用^[7][8]

昆蟲基因組DNA提取試劑盒可用于昆蟲基因組DNA提?。?/p>

對該物種基因組微衛(wèi)星特征和變異進(jìn)行了較深入地分析,并優(yōu)化了鱗翅目成蟲DNA提取的技術(shù)方法。將傳統(tǒng)的蛋白酶K+SDS+苯酚抽提方法和CTAB方法結(jié)合起來,篩選出從東方粘蟲成蟲自然種群的乙醇保存標(biāo)本中提取高質(zhì)量、高產(chǎn)量基因組DNA的方法,用于制備分離微衛(wèi)星標(biāo)記所需的DNA樣品。

對比研究結(jié)果表明,用CTAB+傳統(tǒng)方法提取DNA時,取腹部中段10-20 mg組織樣品進(jìn)行實驗,不同種群DNA產(chǎn)品合格率68.42%-95.28%,提取合格DNA量5.59-10.04 mg/g,顯著高于傳統(tǒng)蛋白酶K+SDS裂解及苯酚抽提方法的7.69%-40%和2.83-5.78 mg/g。另外,用熱NaOH法快速制備用于大規(guī)?；蚍中偷腄NA樣品的研究結(jié)果表明,對于胸部和腹部組織樣品,用熱NaOH溶液處理20 min,就能夠提取出微衛(wèi)星PCR擴(kuò)增反應(yīng)所需的DNA樣品；對于頭部組織樣品,用熱NaOH溶液處理40-60 min是比較合適的。

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