背景^[1-6]

土壤基因組DNA提取試劑盒通過Buffer SCL裂解釋放出基因組DNA，Buffer SP低溫沉淀蛋白等雜質(zhì)，再通過氯仿進(jìn)一步純化。但獲得的土壤基因組中可能含有腐殖酸，可與的土壤腐殖酸清除劑（DT81714）聯(lián)合使用，去除土壤中的腐殖酸，避免腐殖酸對(duì)后續(xù)實(shí)驗(yàn)的干擾。試劑盒可從200 mg土壤中可以獲得5~15μg DNA，OD260/OD280比值一般在1.7~1.9之間。抽提出的DNA可用于酶切、PCR、文庫(kù)構(gòu)建、Southern Blot等相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

標(biāo)準(zhǔn)操作步驟：

如非指出，所有離心步驟均為使用臺(tái)式離心機(jī)在室溫下離心。

1.稱0.3-0.5 g土壤置于2ml離心管中，加入0.4 g Glass Beads，再加入700μl緩沖液R1與100μl緩沖液R2。渦旋器高速震蕩3-5min。

注意：對(duì)含水量豐富的樣品，可以預(yù)先離心除去部分水分后再稱取樣品。緩沖液R2是腐殖酸去除劑，100μl對(duì)大部分樣品來(lái)說(shuō)足以有效除去腐殖酸等抑制因子。對(duì)一些腐殖酸含量特別豐富的土壤，緩沖液R2的量可以適當(dāng)增加，但不能超過250μl，否則會(huì)嚴(yán)重影響DNA的得率。

2.加入100μl緩沖液R3（R3如有沉淀37℃水浴完全溶解后再用），渦旋混勻。70℃水浴處理10min。期間振蕩幾次。

3.12000 rpm(~13,000g)離心1分鐘，取600μl上清到1.5ml離心管中，加入180μl緩沖液R4混勻。

4.冰上放置5分鐘。12000 rpm(~13,000g)離心1分鐘。轉(zhuǎn)移上清到新的1.5ml離心管中。

5.加入與上清等體積的緩沖液R5（使用前請(qǐng)檢查是否已加入異丙醇），顛倒混勻。

6.取750μl混合液加到吸附柱中（吸附柱放入收集管中），12000 rpm(~13,000g)離心30秒，倒掉濾出液。

7.將剩余的混合液加到吸附柱中（吸附柱放入收集管中），12000rpm(~13,000g)離心30秒，倒掉濾過液。

8.向吸附柱CG中加入500μl漂洗緩沖液WB1，12,000 rpm(~13,000×g)離心30秒，倒掉廢液。

9.向吸附柱CG中加入600μl漂洗緩沖液PW(使用前請(qǐng)先檢查是否已加入無(wú)水乙醇)，12,000 rpm(~13,000g)離心30秒，倒掉廢液，吸附柱CG放入收集管中。

10.向吸附柱CG中加入600μl漂洗緩沖液PW，12,000 rpm(~13,000g)離心30秒，倒掉廢液，將吸附柱CG放入收集管中。

11.12,000 rpm(~13,000g)離心2分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液。

12.將吸附柱CG轉(zhuǎn)入一個(gè)干凈的1.5ml離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加50–100μl經(jīng)70℃水浴預(yù)熱的洗脫緩沖液EB，室溫放置2分鐘，12,000 rpm(~13,000g)離心2分鐘。

13.DNA產(chǎn)物-20℃保存。

DNA濃度及純度檢測(cè)：

基因組DNA片段的大小與樣品保存時(shí)間、操作過程中的剪切力等因素有關(guān)。提取的DNA片段可用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)檢測(cè)濃度與純度?？膳渲?.8-1.0％瓊脂糖凝膠，使用λ/HindIII判斷基因組的大小，完整的基因組大小應(yīng)在23kb以上。

使用分光光度計(jì)檢測(cè)時(shí)，OD260/OD280比值應(yīng)為1.7–1.9之間，如果洗脫時(shí)不使用洗脫緩沖液，而使用去離子水洗脫，比值可能偏低，但并不表明DNA純度不高。

應(yīng)用^[7][8]

土壤基因組DNA提取試劑盒可用于土壤基因組DNA提?。?/p>

建立了兩種從濕地土壤中提取微生物總DNA的方法,即氯化鈣-SDS-酶法(新方法1)和玻璃珠-氯化鈣-SDS法(新方法2)。在直接提取DNA過程中采用氯化鈣去除腐殖酸,DNA提取緩沖液中不使用EDTA螯合劑,提取過程用時(shí)分別為4 h左右和2 h。氯化鈣-SDS-酶法與中科院土壤DNA提取法以及國(guó)產(chǎn)試劑盒兩種方法相比,可高效去除濕地土壤腐殖酸,純度較高,滿足16S rDNA的PCR擴(kuò)增,為微生物生態(tài)學(xué)研究提供了一種高效的濕地土壤微生物總DNA提取和純化技術(shù)。但

方法1應(yīng)用于微生物功能基因的研究受到限制,基于以上原因,我們對(duì)氯化鈣-SDS-酶法進(jìn)行改進(jìn)。依據(jù)微生物不均勻地分布在微團(tuán)聚體內(nèi)部以及微團(tuán)聚體外部的孔隙中并通過不同的結(jié)合機(jī)制緊密地結(jié)合到土壤顆粒上以及氨氧化細(xì)菌(AOB)具有依附性的特點(diǎn),通過玻璃珠分散土壤顆粒內(nèi)部和表面結(jié)合的細(xì)胞,最終獲得一種適用于氨氧化細(xì)菌(AOB)和氨氧化古菌(AOA)amoA基因片段PCR擴(kuò)增的快速DNA提取方法,即玻璃珠-氯化鈣-SDS法,與氯化鈣-SDS-酶法和UltraCleanTM Soil DNA Isolation Kit試劑盒進(jìn)行比較,對(duì)16S rDNA、AOB和AOA中amoA基因片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

參考文獻(xiàn)

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