背景^[1-3]

SART3抗體是一種可以特異性結(jié)合SART3的人工合成抗體，可以靶向結(jié)合人、小鼠、大鼠和豬樣品中的SART3蛋白。SART3抗體可用于多種科學(xué)應(yīng)用，包括Western Blot、免疫組織化學(xué)、免疫細(xì)胞化學(xué)、免疫沉淀和ELISA。

SART3是肌鈣蛋白復(fù)合物的抑制亞基，其作用是抑制肌球蛋白ATP酶活性。SART3基因位于染色體19p1上，由8個(gè)外顯子組成，編碼210個(gè)氨基酸，5%左右的HCM是由這些突變所致，大部分為錯(cuò)義突變或缺失突變。TNNI3突變表現(xiàn)為混合型、形態(tài)學(xué)特征不明顯的心肌病，國(guó)外研究發(fā)現(xiàn)TNNI3的第186位氨基酸由精氨酸變?yōu)楦拾彼?，這種突變使兩個(gè)家族成員表現(xiàn)出肥厚性心肌病和左心室非致密化不全的混合形態(tài)特征。而這兩種類型的心肌病均不明顯，兩個(gè)家庭成員中有4位在30歲之前猝死，提示該基因突變預(yù)后較差。對(duì)13例家系的HCM患者進(jìn)行SART3基因篩查，首次在國(guó)內(nèi)發(fā)現(xiàn)SART3基因第157位氨基酸由丙氨酸變?yōu)槔i氨酸，攜帶該突變的家系的患者晚期有心肌變薄、心腔擴(kuò)張的趨勢(shì)。

SART3抗體

SART3抗體使用步驟（Western Blot）：

1.樣本制備

1）融解RIPA裂解液（RIPA裂解液-細(xì)胞/組織裂解液緩沖液），混勻。

2）貼壁細(xì)胞：去除培養(yǎng)液，用PBS、生理鹽水或無(wú)血清培養(yǎng)液洗一遍。加入150-250μL裂解液的比例加入裂解液。

3）充分裂解后，10000-14000g離心3-5min，取上清，即可進(jìn)行后續(xù)的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。

2.蛋白電泳

1）取出預(yù)制膠，將預(yù)制膠固定在電泳槽中，內(nèi)槽加滿tris-glycine電泳緩沖液。

2）在室溫或不超過(guò)37℃的水浴中溶解5XSDS-PAGE上樣緩沖液。水浴溶解后立即室溫存放。

3）混合蛋白樣品和5XSDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。

4）100℃或沸水浴加熱3-5min，以充分變性蛋白，之后冷卻至室溫備用。

5）上樣蛋白，并在1個(gè)孔中上樣蛋白marker，蓋上電泳槽蓋，打開電源，電泳至藍(lán)色染料到達(dá)膠的底端處附近即可停止電泳。

6）電泳后取出膠板，用刀在側(cè)邊硅膠處，沿著兩片玻璃縫隙切開硅膠，即可打開玻璃板；取膠時(shí)。

3.轉(zhuǎn)膜與封閉

1）將膠浸于預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡5min。

2）依據(jù)膠的大小剪取膜和濾紙6片，放入預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡10min，如用PVDF膜，需參照說(shuō)明書，先用純甲醇浸泡1-2min，再孵育于預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液中。

3）裝配轉(zhuǎn)移三明治：海綿/3層濾紙/膠/膜/3層濾紙/海綿，每層放好后，用試管趕盡氣泡。

4）將轉(zhuǎn)移槽置于冰浴中，放入三明治，膜靠近陽(yáng)極，膠靠近陰極，加入轉(zhuǎn)移緩沖液，插上電極，100V，1h（電流約為0.3A）。

5）轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，切斷電源，取出膜。

6）將膜浸沒(méi)在5mL麗春紅染色液中，置于軌道搖床上室溫染色5~10min或更長(zhǎng)，直待膜上顯示出蛋白條帶。

7）清洗：取出膜，用蒸餾水，PBS或者其他適當(dāng)溶液沖洗至背景清晰后拍照，大概沖洗2~3次，每次5min。

8）脫色：將膜放到0.1N NaOH溶液漂洗5min；倒去洗脫液，再重復(fù)一次。

9）清洗：再用蒸餾水清洗膜2~3次，每次5min。

10）將膜置于25mL封閉緩沖液中，在室溫下孵育1小時(shí)。

11）用5mL TBST洗滌三次，每次15min。

4.抗體孵育與檢測(cè)

1）將膜和一抗（SART3抗體按照產(chǎn)品應(yīng)用推薦稀釋度）置于10mL一抗稀釋緩沖液中在4℃下孵育過(guò)夜并不時(shí)輕輕晃動(dòng)。

2）用5mL TBST洗滌三次，每次15min以去除殘留的一抗(SART3抗體)。

3）將膜和二抗（按照產(chǎn)品應(yīng)用推薦稀釋度）置于10mL封閉緩沖液中孵育1-2小時(shí)并不時(shí)輕輕晃動(dòng)。

4）用5mL TBST洗滌三次，每次15min。

5）最后一次洗膜的同時(shí)，按照ECL超敏試劑盒說(shuō)明書，新鮮配制發(fā)光工作液。

6）用平頭鑷取出膜，搭在濾紙上瀝干洗液。將膜完全浸入發(fā)光工作液中，與發(fā)光工作液充分接觸。室溫孵育3min，準(zhǔn)備立即壓片曝光。但勿洗去發(fā)光液。

7）顯影曝光。

應(yīng)用^[4][5]

SART3抗體可以用于SART3在DNA損傷修復(fù)中的功能初探

通過(guò)構(gòu)建帶有GFP綠色熒光標(biāo)簽的質(zhì)粒,再利用激光誘導(dǎo)活細(xì)胞產(chǎn)生DNA損傷,在軟件的多維圖像采集及分析下探究細(xì)胞核內(nèi)的熒光動(dòng)態(tài)變化,根據(jù)動(dòng)態(tài)變化圖能分析出帶有GFP標(biāo)簽的SART3蛋白能夠比較快速地募集到DNA損傷位點(diǎn)。接著我們?cè)儆眉す庹T導(dǎo)活細(xì)胞產(chǎn)生DNA損傷,通過(guò)SART3抗體免疫熒光實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了SART3在DNA損傷位點(diǎn)處的募集。說(shuō)明SART3能夠募集到DNA損傷位點(diǎn)上并且可能在DNA損傷修復(fù)中發(fā)揮著比較重要的作用。

觀察SART3蛋白在細(xì)胞核內(nèi)DNA損傷位點(diǎn)處的動(dòng)態(tài)募集情況,不難發(fā)現(xiàn),SART3能夠十分快速地被招募到損傷位點(diǎn)處,并在4 min左右開始彌散直至恢復(fù)到損傷之前的水平。這能夠說(shuō)明SART3在DNA損傷修復(fù)過(guò)程中或許扮演著比較重要的角色。然后為了繼續(xù)研究SART3的各個(gè)相關(guān)結(jié)構(gòu)域與激光誘導(dǎo)活細(xì)胞產(chǎn)生DNA損傷位點(diǎn)處募集情況的關(guān)聯(lián),我們構(gòu)建了帶有GFP熒光標(biāo)簽的SART3的一系列突變體。結(jié)果發(fā)現(xiàn)p EGFP-C1-Flag-SART3 D2、p EGFP-C1-FlagSART3 D5和p EGFP-C1-Flag-SART3 D8在經(jīng)過(guò)激光誘導(dǎo)活細(xì)胞損傷之后,無(wú)法參與到DNA損傷位點(diǎn)的修復(fù)上。由于通過(guò)一系列實(shí)驗(yàn)我們已經(jīng)證明了SART3能夠參與到DNA損傷修復(fù)中,但是對(duì)于其具體作用機(jī)制我們還不清楚,因此使用了幾種比較常見(jiàn)的化療藥物來(lái)處理被SART3-si RNA敲低過(guò)的細(xì)胞,來(lái)初步判斷SART3主要是參與到哪種化療藥物誘導(dǎo)的DNA損傷反應(yīng)當(dāng)中,結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組(野生型細(xì)胞)相比,實(shí)驗(yàn)組對(duì)化療藥物順鉑的耐藥性明顯升高。接下來(lái)從SART3抗體蛋白免疫印記實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn),用順鉑處理細(xì)胞,細(xì)胞內(nèi)SART3的蛋白水平明顯上升,這說(shuō)明SART3與順鉑誘導(dǎo)的DNA損傷修復(fù)是有關(guān)聯(lián)的。為了進(jìn)一步探究SART3在DNA損傷修復(fù)中的作用,在DNA損傷修復(fù)相關(guān)基因缺陷型的小鼠成纖維細(xì)胞模型中,分析SART3在DNA損傷位點(diǎn)的募集情況?？梢园l(fā)現(xiàn)在PARP1缺陷型的細(xì)胞中SART3的募集情況相較于其在野生型中,募集程度明顯減弱,接著再用PARP抑制劑Olaparib處理細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)SART3在DNA損傷位點(diǎn)處的募集也大幅度降低。這些結(jié)果說(shuō)明了SART3參與到DNA損傷修復(fù)的過(guò)程可能受DNA損傷修復(fù)因子PARP1的調(diào)控。

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