背景[1-3]
血清封閉劑是免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)中常用的一種試劑,主要用于減少或消除非特異性結(jié)合背景的影響。常見(jiàn)的封閉劑包括脫脂奶粉、牛血清白蛋白(BSA)、動(dòng)物血清和Fab片段單鏈二抗等。這些封閉劑的作用是封閉固相載體上的未結(jié)合位點(diǎn),從而減少一抗和二抗與非靶標(biāo)位點(diǎn)的非特異性結(jié)合。
脫脂奶粉:便宜且適用范圍較窄。由于成分復(fù)雜,可能含有生物素、堿性磷酸酶,不適合用于磷酸化蛋白檢測(cè)和生物素標(biāo)記的抗體系統(tǒng)。
牛血清白蛋白(BSA):成分單一,適用于大多數(shù)情況。BSA可能含有少量的抗體殘留,可能導(dǎo)致交叉反應(yīng)。建議使用不含IgG的BSA產(chǎn)品。
動(dòng)物血清:封閉血清主要用于免疫組化(IHC)或免疫熒光(IF)實(shí)驗(yàn)中樣本的封閉,以降低背景和減少假陽(yáng)性。血清中動(dòng)物自身的抗體,預(yù)先能和組織中有交叉反應(yīng)的位點(diǎn)發(fā)生結(jié)合,從而減少背景。
Fab片段單鏈二抗:也常用于免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)中的封閉。
在選擇封閉劑時(shí),應(yīng)考慮實(shí)驗(yàn)的具體要求,如特異性、背景信號(hào)、成本等因素。例如,在ELISA實(shí)驗(yàn)中,常用5%脫脂奶粉或BSA封閉膜上除轉(zhuǎn)印蛋白占據(jù)的其它部位;在Western Blotting實(shí)驗(yàn)中,為減少非特異性條帶,可在用一抗孵育前使用適當(dāng)?shù)淖钄嘣噭┳钄嗄ぁ?/p>
血清封閉劑
定義與來(lái)源
定義:血清封閉劑是將養(yǎng)殖的非免疫的正常動(dòng)物采血后,不加抗凝劑使血液凝固,血塊收縮析出的淡黃色液體,經(jīng)過(guò)特殊工藝處理而成。它特別適用于各類免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)中的封閉處理。
來(lái)源:通常來(lái)源于牛、羊、兔等非免疫的正常動(dòng)物。
血清封閉劑作用機(jī)制
封閉劑能夠占據(jù)樣本中的“黏性”位點(diǎn),如暴露的帶電性或疏水性蛋白表面,從而阻止一抗和二抗與非靶標(biāo)位點(diǎn)的非特異性結(jié)合。
它還可以封閉樣品中內(nèi)源性的Fc片段結(jié)合位點(diǎn),阻斷抗體與樣品中的Fc受體結(jié)合,進(jìn)而降低背景信號(hào),減少假陽(yáng)性結(jié)果。
血清封閉劑應(yīng)用場(chǎng)景
血清封閉劑在免疫組化(IHC)和免疫熒光(IF)等實(shí)驗(yàn)中廣泛應(yīng)用,用于封閉樣本中的非特異性結(jié)合位點(diǎn)。
它也適用于ELISA等其他免疫學(xué)實(shí)驗(yàn),以提高實(shí)驗(yàn)的特異性和靈敏度。
血清封閉劑使用方法
血清封閉劑通常以液體形式提供(原液),無(wú)需溶解,可直接用PBS等緩沖液稀釋后使用。
在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求將適量封閉劑加入到樣本中,進(jìn)行一定時(shí)間的孵育即可。
血清封閉劑儲(chǔ)存與穩(wěn)定性
血清封閉劑應(yīng)儲(chǔ)存在適當(dāng)?shù)臏囟认?,長(zhǎng)時(shí)間儲(chǔ)存在2~8℃時(shí),血清中的各種蛋白和脂蛋白可能聚集而形成沉淀或可見(jiàn)的混濁。因此,推薦在-20℃以下儲(chǔ)存血清,并避免反復(fù)凍融。
如果開(kāi)蓋后未使用完,建議存放于4℃,但請(qǐng)勿超過(guò)一個(gè)月。
應(yīng)用[4][5]
血清封閉劑可以用于胃蛋白酶在喉癌中的表達(dá)及作用
利用熒光定量PCR和Western Blotting技術(shù)檢測(cè)喉癌細(xì)胞在Pepsin刺激后多個(gè)上皮、間質(zhì)標(biāo)志物的變化情況,從而證實(shí)Pepsin是否誘導(dǎo)喉癌細(xì)胞發(fā)生EMT,為深入理解咽喉反流是否參與喉癌發(fā)生發(fā)展提供理論基礎(chǔ)。
材料和方法1.臨床標(biāo)本收集18例聲帶白斑組織和21例喉癌組織均取自南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院因聲帶白斑及喉癌(T1-3N1M0)擬行手術(shù)治療的患者,手術(shù)中取喉病變組織標(biāo)本,所有患者均尚未接受放化療治療。16例健康喉上皮組織在南方醫(yī)院耳鼻喉科門診表麻纖維電子喉鏡下取聲帶近室?guī)幱坞x緣處組織,所有受試者要求檢查前2周內(nèi)無(wú)服用質(zhì)子泵抑制劑、促胃腸動(dòng)力藥物。本研究經(jīng)南方醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),所有患者及健康志愿者均自愿加入且簽署參與研究的知情同意書。2.24小時(shí)多通道腔內(nèi)阻抗-pH(MII-pH)監(jiān)測(cè):采用ZepHr多通道腔內(nèi)阻抗-pH監(jiān)測(cè)便攜系統(tǒng)(Sandhill scientific inc,美國(guó))及型號(hào)ZAI-BL-48E單根分叉型電極,電極直徑2.3 mm,共有6個(gè)阻抗通道,分別位于LES上方3 cm、5 Cm、7 cm、9 cm以及UES下方3 cm、5 cm;2個(gè)pH監(jiān)測(cè)位點(diǎn)分別位于LES上方5 cm和UES上方1 cm。監(jiān)測(cè)電極使用前均行pH 4.0和pH 7.0校準(zhǔn)液定標(biāo)校準(zhǔn)。監(jiān)測(cè)前患者禁食水至少8 h,取臥位,經(jīng)鼻插入監(jiān)測(cè)導(dǎo)管,根據(jù)食管動(dòng)力監(jiān)測(cè)定位LES位置,胸前固定外置參考電極。調(diào)整ZepHr多通道腔內(nèi)阻抗-pH監(jiān)測(cè)便攜系統(tǒng)開(kāi)始記錄咽喉反流及胃食管反流數(shù)據(jù)。告知患者注意事項(xiàng),囑其次日同一時(shí)間返回檢查室(保證檢查時(shí)間大約24 h),拆除儀器,結(jié)束檢查。監(jiān)測(cè)記錄數(shù)據(jù)處理采用Bioview反流分析軟件(Sandhill Scientific),輸出反流波形圖和反流數(shù)據(jù)報(bào)告。24小時(shí)多通道腔內(nèi)阻抗-pH(MII-pH)監(jiān)測(cè)結(jié)果判讀:咽喉酸反流次數(shù)≥2次為咽喉反流陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn),DeMeester≥14.7分為胃食管反流陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)。3.免疫組化將石蠟切片進(jìn)行脫蠟、抗原修復(fù)、阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶、血清封閉劑封閉、抗體孵育、DAB顯色、復(fù)染、透明、封片等步驟進(jìn)行,免疫組化的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行半定量判定。隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野,按鱗狀上皮細(xì)胞或鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的胞漿顯色深淺評(píng)分,無(wú)顯色為陰性記0分,淺褐色為弱陽(yáng)性記1分,棕褐色為陽(yáng)性記2分,顆粒狀深棕褐色為強(qiáng)陽(yáng)性記3分;按顯色組織的比例評(píng)分:顯色<25%為1分,顯色25%~50%為2分,顯色51%~75%為3分,顯色>75%為4分。根據(jù)二者的乘積將顯色程度分為4級(jí),0分為陰性記0級(jí),1~4分為弱陽(yáng)性記1級(jí),5~8分為陽(yáng)性記2級(jí),9~12分為強(qiáng)陽(yáng)性記3級(jí)。4.細(xì)胞培養(yǎng)人喉癌細(xì)胞株Hep-2,采用含10%胎牛血清和1%青鏈霉素雙抗RPMI 1640培養(yǎng)基,在37℃、5%CO2、飽和濕度的條件下傳代培養(yǎng)。采用對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。
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