概述^[1]

gRNA文庫的建立將為重要基因功能的篩選、疾病機制研究及藥物研發(fā)等方面提供新的動力，大大加快人類功能基因組研究計劃的進展。

構(gòu)建方法^[1]

CRISPR-Cas9系統(tǒng)是一種強大的基因組編輯工具，如風(fēng)暴一般席卷了整個基因組工程領(lǐng)域。最近Andrea Ventura等人報道了這一系統(tǒng)在gRNA 文庫構(gòu)建方面的應(yīng)用，而這樣的應(yīng)用往往需要同時表達一對gRNA，比如用Cas9切口酶進行大片段刪除。CRISPR-Cas9是細菌在漫長的進化過程中演化出的重要防御機制。這個監(jiān)控體系能夠根據(jù)引導(dǎo)RNA（gRNA）的指示，靶標并降解入侵者的遺傳物質(zhì)。

現(xiàn)在，CRISPR-Cas9已經(jīng)成為了炙手可熱的基因組編輯工具，幫助世界各地的研究者們解決實際問題。近年來，這一技術(shù)在多個領(lǐng)域中展現(xiàn)了自己強大的實力，催生了大量的重要成果。人們發(fā)現(xiàn)，同時表達內(nèi)切酶Cas9與gRNA，可以誘導(dǎo)真核細胞發(fā)生雙鏈DNA斷裂。在真核生物中，雙鏈DNA斷裂主要通過容易出錯的非同源末端連接進行修復(fù)，會在目標位點形成小indel（插入缺失）。因此，CRISPR-Cas9系統(tǒng)是破壞基因編碼框的一種簡單途徑。研究表明，CRIPSR-Cas9可以高效靶標多個基因，實現(xiàn)大規(guī)模的功能缺失篩選。

研究人員開發(fā)了一個快速制備配對gRNA文庫的有效方法，大大拓展了CRIPSR在功能篩選方面的應(yīng)用。該方法可以將寡核苷酸池中的一對gRNA克隆到任意CRISPR 表達載體上，還可以確保兩個gRNA使用獨立的啟動子。研究顯示，一個慢病毒載體上的兩個gRNA不適合使用相同的啟動子。研究人員為此構(gòu)建了新型慢病毒載體，搭載一個人類U6啟動子和一個經(jīng)過改良的鼠類U6啟動子。這項研究為人們提供了一個簡單、快速又便宜的配對gRNA文庫制備法，大大拓展了CRISPR技術(shù)在功能基因組學(xué)研究中的應(yīng)用前景。

主要參考資料

[1] Rapid and efficient one-step generation of paired gRNA CRISPR-Cas9 libraries