背景^[1-3]

EL4是一種來源于小鼠的淋巴瘤細(xì)胞系，常被用作生物醫(yī)學(xué)研究的模型系統(tǒng)。這種細(xì)胞系具有特定的生物學(xué)特性和廣泛的應(yīng)用價值，尤其在免疫學(xué)、腫瘤學(xué)和藥物篩選等領(lǐng)域中備受關(guān)注。

EL4細(xì)胞系具有快速增殖和易于培養(yǎng)的特點，這使得它成為研究淋巴細(xì)胞生物學(xué)行為的理想模型。此外，EL4細(xì)胞系還具有一些特定的基因表達(dá)模式和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，這使得它成為研究腫瘤發(fā)生和發(fā)展機(jī)制的重要工具。

在免疫學(xué)研究中，EL4細(xì)胞系常被用作T細(xì)胞淋巴瘤的模型，用于研究T細(xì)胞的增殖、分化和凋亡等生物學(xué)過程。同時，EL4細(xì)胞系也可用于研究腫瘤免疫逃逸機(jī)制，以及免疫療法對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。

在藥物篩選方面，EL4細(xì)胞系具有對多種化療藥物的敏感性，因此常被用作藥物篩選的模型。通過研究藥物對EL4細(xì)胞系的殺傷作用，可以評估藥物的抗腫瘤活性，為臨床用藥提供參考。

EL4

EL4細(xì)胞系培養(yǎng)操作

1)復(fù)蘇EL4細(xì)胞系：以下細(xì)胞培養(yǎng)凍存處理僅供參考，具體操作步驟以隨貨產(chǎn)品說明書為主。

將含有1 mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加4 mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000 rpm條件下離心3 min，棄去上清液，加1-2 mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入含適量培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入10 cm皿中，加入約8 mL培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。

2)EL4細(xì)胞系傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

a、棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細(xì)胞1-2次。

b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，使消化液浸潤所有細(xì)胞，棄去消化液，將培養(yǎng)瓶置于37℃培養(yǎng)箱中消化1 min，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。

c、按6-8 mL/瓶補加培養(yǎng)基，輕輕打勻后裝入無菌離心管中，1000 rpm離心4 min，棄去上清液，補加1-2 mL培養(yǎng)液后吹勻。

d、將細(xì)胞懸液按1:2比例分到新的含8 mL培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

3)EL4細(xì)胞系凍存：待細(xì)胞生長狀態(tài)良好時，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。下面T25瓶為例；

a、收集細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液，裝入無菌離心管中，1000 rpm條件下離心4 min，棄去上清液，用PBS清洗一遍，棄盡PBS，進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)。

b、根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加入無血清細(xì)胞凍存液，使細(xì)胞密度5×106~1×107/mL，輕輕混勻，每支凍存管凍存1mL細(xì)胞懸液，注意凍存管做好標(biāo)識。

c、將凍存管放入-80℃冰箱，24 h后轉(zhuǎn)入液氮灌儲存。記錄凍存管位置以便下次拿取。

應(yīng)用^[4-5]

EL4可以用于S1P信號通路影響肥胖合并淋巴瘤侵襲性生長機(jī)制研究

為肥胖合并淋巴瘤患者這一特殊患者群體,通過改善脂代謝提高預(yù)后提供理論依據(jù)。

方法:1.在人標(biāo)本實驗中:對人NHL微組織陣列樣本進(jìn)行S1P水平免疫組化染色;對于常見亞型非霍奇金淋巴瘤,使用GEO數(shù)據(jù)庫研究用于S1P生物合成的兩種鞘氨醇激酶(SPHK1和SPHK2)的基因表達(dá)。進(jìn)一步證實非霍奇金淋巴瘤存在鞘脂代謝異常。

2. 構(gòu)建肥胖小鼠模型:出生6周C57BL/6J小鼠,西方高脂肪飲食(western style high fat diet,WSHFD,35%w/w脂肪和26%w/w果糖通)及其對照飲食喂養(yǎng)16周,構(gòu)建肥胖脂代謝異常小鼠模型。(1)對小鼠進(jìn)行體重、脂肪重量測定、用ELISA測定血清甘油三酯水平,驗證脂質(zhì)代謝異常小鼠模型建模成功;(2)應(yīng)用western blot對小鼠脂肪組織進(jìn)行脂肪酸分解酶p HSL、HSL檢測;應(yīng)用免疫組化對脂肪組織中IRS,MPO進(jìn)行檢測;探討肥胖對脂代謝異常及炎癥反應(yīng)兩方面影響；

3. 在脂代謝異常小鼠背景下,皮下種植小鼠EL4細(xì)胞(T細(xì)胞淋巴瘤),建立淋巴瘤模型。分為EL4-CD、EL4-WSHFD兩組,監(jiān)測21天內(nèi)小鼠體重、腫瘤大小變;21天后處死小鼠,評估腫瘤重量,依據(jù)病理仿照臨床Ann-Arbor分期評估累及范圍;通過western blot檢測兩組c-MYC,CCND1,E-cadherin,Vimentin;ELISA測定兩組血清及淋巴瘤組織甘油三酯水平;探討脂代謝異常對淋巴瘤增殖及EMT的影響。

4. EL4-CD、EL4-WSHFD兩組小鼠通過RT-PCR檢測脂質(zhì)代謝通路及S1P通路代謝酶,通過western blot,免疫組化檢測兩組p SPHK1/SPHK1,S1PR1,S1PR3蛋白質(zhì)表達(dá)水平;探討脂代謝異常對淋巴瘤FA的外源性攝取及內(nèi)源性合成的影響及對S1P通路影響。

5. 應(yīng)用細(xì)胞實驗探索S1P對淋巴瘤增殖及EMT的機(jī)制:測定人HH、SUDHL-4淋巴瘤細(xì)胞系S1PR表達(dá),空白對照、S1P、S1PR抑制劑處理人HH、SU-DHL-4淋巴瘤細(xì)胞系,通過XTT方法測定增殖,transwell評估細(xì)胞遷移,western blot測定S1P-S1PR下游YAP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。

6. 探索S1P對腫瘤微環(huán)境巨噬細(xì)胞的影響:動物實驗:構(gòu)建脂代謝異常EL4淋巴瘤小鼠模型腹水淋巴瘤瘤模型;通過免疫熒光及流式細(xì)胞學(xué)檢測淋巴瘤微環(huán)境中骨髓衍生抑制細(xì)胞(MDSCs)CD11b+Ly6Chi及腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞F4/80+CD206+表達(dá);CD4+、CD8+T細(xì)胞比例；

7.通過細(xì)胞實驗探索S1P誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞極化機(jī)制:探索巨噬細(xì)胞ALOX15表達(dá)實驗:通過免疫組化探索脂代謝異常EL4小鼠淋巴瘤ALOX15表達(dá);并用人單核細(xì)胞THP定向刺激分化成M1、M2,S1P驗證ALOX15在M1、M2中表達(dá)情況;WT小鼠及Alox15-/-小鼠經(jīng)CD和WSHFD喂養(yǎng)后,構(gòu)建小鼠腹腔淋巴瘤模型,流式細(xì)胞術(shù)檢測腹腔積液CD11b+Ly6Chi及腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞F4/80+CD206+表達(dá);8.構(gòu)建脂代謝異常EL4淋巴瘤小鼠模型,給予白藜蘆醇和PDL1抑制劑治療,探索白藜蘆醇通過改善S1P代謝,對淋巴瘤增殖的抑制作用及對PDL1的協(xié)同作用。

參考文獻(xiàn)

[1]Eicosanoids in Cancer:New Roles in Immunoregulation[J].Johnson Amber M.;Kleczko Emily K.;Nemenoff Raphael A..Frontiers in Pharmacology,2020

[2]Efferocytosis potentiates the expression of arachidonate 15-lipoxygenase(ALOX15)in alternatively activated human macrophages through LXR activation.[J].Snodgrass Ryan G;Benatzy Yvonne;Schmid Tobias;Namgaladze Dmitry;Mainka Malwina;Schebb Nils Helge;Lütjohann Dieter;Brüne Bernhard.Cell death and differentiation,2020

[3]M2?TAM subsets altered by lactic acid promote T?cell apoptosis through the PD?L1/PD?1 pathway.[J].Tao Shan;;Shuo Chen;;Xi Chen;;Tao Wu;;Yi Yang;;Shunle Li;;Jiancang Ma;;Jing Zhao;;Wanrun Lin;;Wei Li;;Xijuan Cui;;Ya'an Kang.Oncology reports,2020(5)

[4]Significance of sphingosine-1-phosphate in cardiovascular physiology and pathology[J].E.Jozefczuk;;T.J.Guzik;;M.Siedlinski.Pharmacological Research,2020

[5]王興彤.S1P信號通路影響肥胖合并淋巴瘤侵襲性生長機(jī)制研究[D].吉林大學(xué),2022.