背景及概述^[1]

CRISPR/Cas9 (Clustered regulatory interspaced short palindromic repeats/ CRISPR-associated protein 9) 技術(shù)是最近發(fā)現(xiàn)的一種基因組靶向修飾技術(shù)。與之前的技術(shù)相比，CRISPR/Cas9技術(shù)是通過一段RNA來識別靶位點(diǎn)，因而在設(shè)計(jì)和構(gòu)建上更加簡單。迄今為止，CRISPR/Cas9技術(shù)已成功應(yīng)用于肺炎鏈球菌Streptococcus pneumoniae、大腸桿菌Escherichia coli、芽殖酵母Saccharomyces cerevisiae、秀麗線蟲Caenorhabditis elegans、果蠅Drosophilamelanogaster、斑馬魚Danio rerio、小鼠Mus musculus、大鼠Rattus norvegicus、擬南芥、玉米Zea mays、水稻和小麥Triticum aestivum以及包括iPS細(xì)胞在內(nèi)的人體外培養(yǎng)細(xì)胞系等多個物種內(nèi)源性基因的定點(diǎn)修飾。因此CRISPR/Cas9 載體設(shè)計(jì)與構(gòu)建非常重要。

作用機(jī)理^[1]

當(dāng)外源DNA入侵細(xì)菌時，其CRISPR系統(tǒng)會特異性地捕獲一段被稱為proto-spacers的外源DNA序列插入到前導(dǎo)序列與間隔重復(fù)序列之間，并伴隨一次重復(fù)片段的復(fù)制，這樣就形成了一段新的重復(fù)單元，這些重復(fù)單元就是細(xì)菌特異性免疫的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。需要注意的是，外源DNA的捕獲并不是完全隨機(jī)的，在這些被捕獲的DNA序列下游常有一段序列保守的特殊結(jié)構(gòu)，被稱為PAM位點(diǎn)PAM位點(diǎn)的存在可能是CRISPR系統(tǒng)區(qū)分自身DNA與外源DNA而避免發(fā)生自身免疫的機(jī)制之一，同時也是基因編輯時靶序列選擇的重要要求。之后，形成的重復(fù)單元會被轉(zhuǎn)錄形成前體CRISPR RNA (Pre-crRNA)，在RNase Ⅲ的作用下成熟。成熟的crRNA與tracrRNA通過堿基配對形成雙鏈RNA結(jié)構(gòu)，并進(jìn)一步與Cas9蛋白結(jié)合形成靶向切割復(fù)合體對外源DNA進(jìn)行特異切割，達(dá)到識別和降解外源DNA的目的。

根據(jù)上述原理，只需合成定制的crRNA，將其插入到合適的質(zhì)粒中，與分別表達(dá)tracrRNA和Cas9蛋白的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，或體外轉(zhuǎn)錄成RNA后注射到特定細(xì)胞中，就可以建立基因敲除的細(xì)胞系或動物模型。crRNA的作用是通過堿基配對識別基因組靶序列，而不需要像ZFN和TALEN那樣構(gòu)建復(fù)雜的識別蛋白，極大簡化了試驗(yàn)流程。另外，與ZFN和TALEN技術(shù)中用到的FokⅠ不同的是，Cas9蛋白存在HNH和RuvC兩個活性位點(diǎn)可以分別切割與crRNA互補(bǔ)的DNA鏈和非互補(bǔ)鏈，從而引入DSB，不需形成二聚體發(fā)揮作用，而且切割活性特別高。Jinek等^[44]還發(fā)現(xiàn)，將crRNA：tracrRNA雙鏈RNA結(jié)構(gòu)改造成單鏈導(dǎo)向RNA (Single-guide RNA，sgRNA) 同樣能夠指導(dǎo) Cas9蛋白特異切割雙鏈DNA，這進(jìn)一步提高了操作簡便性

制備^[2-3]

CRISPR/Cas9 載體設(shè)計(jì)與構(gòu)建方法1：利用試劑盒快速方便地將gRNA 靶點(diǎn)序列插入到Cas9/gRNA 質(zhì)粒中。構(gòu)建好的Cas9/gRNA質(zhì)粒能夠同時表達(dá)植物密碼子優(yōu)化的Cas9 蛋白及gRNA，應(yīng)用CRISPR 技術(shù)進(jìn)行目標(biāo)基因的敲除和編輯。

CRISPR/Cas9 載體設(shè)計(jì)與構(gòu)建方法2：根據(jù)NtDXR 基因序列，利用在線工具ZiFiT Targeter Version4.2^:選擇合適的靶位點(diǎn)，篩選要求為：①靶位點(diǎn)主要包括20 個堿基，并且這20 個堿基后面是NGG（N 為任意堿基）3 個堿基的PAM 區(qū)（Protospacer adjacent motif，PAM）；②靶位點(diǎn)盡量選擇在基因編碼區(qū)的前端。依據(jù)靶位點(diǎn)設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)引物，上游引物DXR-K-F 為5'-GATTGGAGTGGGAT  TTCTGGTAAG-3'，下游引物DXR-K-R 為5'-AAACCTTACCAGAAATCCCA CTCC-3'。靶位點(diǎn)DNA雙鏈的退火反應(yīng)體系：5×Annealing Buffer for DNA Oligos 4 μL，上下游引物各4 μL（50 μmol/μL），Nuclease-free water 補(bǔ)至20 μ L。反應(yīng)程序：95 ℃ 5 min，每8 s 下降0.1℃，直至25 ℃（約90 min）；4 ℃保存。將退火反應(yīng)得到的產(chǎn)物連接到經(jīng)Bsa I 酶切的CRISPR/Cas9載體pORE-Cas9/ gRNA上。連接體系：退火產(chǎn)物2μL，酶切產(chǎn)物3 μL，10×T4 DNA Ligase Buffer 2μL，T4 DNA Ligase（400 U/μL）1 μL，無菌水補(bǔ)至20 μL。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Trans-T1受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性克隆，用載體上的序列作為上游引物U26-jiance-F（5'-TTAGGTTTACCCGCCAATA-3'）、目的基因上靶位點(diǎn)的反向互補(bǔ)序列為下游引物DXR-K-R（5'-AAACCTTACCAGAAATCCCACTCC-3'）對菌斑進(jìn)行菌落PCR。經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，進(jìn)行測序驗(yàn)證。

主要參考資料

[1] CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因編輯技術(shù)研究進(jìn)展.

[2] 利用CRISPR/CAS9 技術(shù)編輯水稻香味基因Badh2

[3] 基于CRISPR/Cas9技術(shù)的煙草NtDXR基因敲除及功能分析