背景^[1-3]

細(xì)胞凋亡-HOECHST染色試劑盒是一種經(jīng)典的細(xì)胞凋亡檢測方法。這種試劑盒采用Hoechst 33342和碘化丙啶（Propidium Iodide，PI）雙染的方法，可以快速簡便地檢測細(xì)胞凋亡。

細(xì)胞凋亡-HOECHST染色試劑盒

細(xì)胞凋亡-HOECHST染色試劑盒操作步驟：

1.細(xì)胞樣品的制備：

⑴貼壁細(xì)胞：

①小心收集細(xì)胞培養(yǎng)液到一個無菌離心管內(nèi)備用。

②用胰蛋白酶消化細(xì)胞至細(xì)胞可以被輕輕用移液管或槍頭吹打下來時，加入前面收集的細(xì)胞培養(yǎng)液，吹打下所有的貼壁細(xì)胞，并輕輕吹散細(xì)胞。

③收集上述細(xì)胞懸液到離心管內(nèi)，4℃1000g離心3～5 min，使細(xì)胞沉到管底，小心吸取上清并丟棄，可留大約50μl培養(yǎng)液，以免吸走細(xì)胞。

④加入約1ml提前預(yù)冷的PBS，重懸細(xì)胞，并轉(zhuǎn)移至1.5ml無菌離心管，4℃1000g離心3～5min，使細(xì)胞沉到管底。

⑤小心吸取上清并丟棄，可留大約50μl PBS，以免吸走細(xì)胞。輕輕彈擊離心管底以適當(dāng)分散細(xì)胞，避免細(xì)胞成團(tuán)。

⑵懸浮細(xì)胞：

①4℃1000g離心3～5min，使細(xì)胞沉到管底，小心吸取上清并丟棄，可留大約50μl培養(yǎng)液，以免吸走細(xì)胞。

②加入約1ml提前預(yù)冷的PBS，重懸細(xì)胞，并轉(zhuǎn)移至1.5ml無菌離心管，4℃1000g離心3～5min，使細(xì)胞沉到管底。

③小心吸取上清并丟棄，可留大約50μl PBS，以免吸走細(xì)胞，輕輕彈擊離心管底以適當(dāng)分散細(xì)胞，避免細(xì)胞成團(tuán)。

2.配制Cell Stain Buffer工作液：取適量Cell Stain Buffer(2×)與無菌去離子水或蒸餾水等比例混合，即為Cell Stain Buffer工作液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

3.重懸細(xì)胞：取上述收集好的0.1～1×106細(xì)胞，加入0.9ml Cell Stain Buffer工作液，重懸細(xì)胞沉淀。

4.Hoechst 33258/PI染色：

⑴一步法：加入5μl Hoechst 33258 Stain和5μl PI Stain，輕輕混勻，置于冰浴或4℃，孵育20～30min。

⑵兩步法：

①加入5μl Hoechst 33258 Stain，置于37℃水浴，孵育5～15 min

②置于冰水中冷卻后，4℃1000g離心3～5 min，使細(xì)胞沉到管底，棄上層染色液。

③加入0.9ml Cell Stain Buffer工作液，重懸細(xì)胞沉淀。

④加入5μl PI Stain，置于冰浴或4℃，孵育20～30min。

5.細(xì)胞凋亡-HOECHST染色試劑盒檢測與分析：用流式細(xì)胞儀在激發(fā)波長400～500nm檢測藍(lán)色熒光，在大于630nm處檢測紅色熒光，同時檢測光散射情況。采用適當(dāng)分析軟件進(jìn)行細(xì)胞DNA含量分析和光散射分析。如果使用熒光顯微鏡檢測，檢測前4℃1000g離心3～5min沉淀細(xì)胞，用PBS洗滌一次，再涂片觀察紅色熒光和藍(lán)色熒光。對于貼壁細(xì)胞使用熒光顯微鏡檢測，亦可不收集細(xì)胞，棄培養(yǎng)液后直接依次按照上述比例加入試劑(A)、試劑(B)、試劑(C)，冰浴或4℃染色20～30min。染色后PBS洗滌一次，再在熒光顯微鏡下觀察。

細(xì)胞凋亡-HOECHST染色試劑盒染色結(jié)果：在藍(lán)色熒光對紅色熒光的散點圖上，正常細(xì)胞呈低藍(lán)光/低紅光，凋亡細(xì)胞呈高藍(lán)光/低紅光，壞死細(xì)胞呈低藍(lán)光/高紅光。

應(yīng)用^[4][5]

細(xì)胞凋亡-HOECHST染色試劑盒可以用于甘草素誘導(dǎo)人肝癌SMMC-7721細(xì)胞凋亡及其機制的研究

甘草素抑制腫瘤細(xì)胞生長及誘導(dǎo)人肝癌SMMC-7721細(xì)胞凋亡的研究目的:探討甘草素(liquiritigenin)對兩株腫瘤細(xì)胞生長的抑制作用及對人肝癌SMMC-7721細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用的影響。

方法:本研究采用體外培養(yǎng)人結(jié)腸癌Lovo細(xì)胞和人肝癌SMMC-7721細(xì)胞的方法,通過噻唑藍(lán)(MTT)比色法觀察甘草素對腫瘤細(xì)胞增殖的影響;Hoechst染色法和電鏡觀察甘草素誘導(dǎo)SMMC-7721細(xì)胞凋亡的形態(tài)變化;流式細(xì)胞儀檢測甘草素誘導(dǎo)SMMC-7721細(xì)胞凋亡率的變化情況。

結(jié)果:甘草素對Lovo結(jié)腸癌細(xì)胞作用24、48和72h時各劑量組出現(xiàn)生長抑制作用,其最高抑制率分別為15.4%、57.1%和84.7%;對SMMC-7721肝癌細(xì)胞作用24、48和72h時,各劑量組都已出現(xiàn)生長抑制作用,最高抑制率分別達(dá)到85.6%、94.2%和91.3%,并呈現(xiàn)明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系。甘草素0.4mM作用SMMC-7721細(xì)胞12、24、48和72h,Hoechst染色觀察可見細(xì)胞核呈致密濃染,或呈碎塊狀致密濃染;透射電鏡觀察可見0.4mM甘草素作用細(xì)胞72h后,細(xì)胞染色質(zhì)濃縮、空泡。流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn),甘草素可誘導(dǎo)SMMC-7721細(xì)胞凋亡,并呈時間-劑量效應(yīng)關(guān)系,甘草素劑量為0.6mM作用24h后,即可引起23.52%的細(xì)胞發(fā)生凋亡。

結(jié)論:甘草素對人結(jié)腸癌Lovo細(xì)胞和人肝癌SMMC-7721細(xì)胞的生長均有抑制作用,其中對SMMC-7721肝癌細(xì)胞的生長抑制作用更加明顯,并能誘導(dǎo)SMMC-7721肝癌細(xì)胞細(xì)胞凋亡。

參考文獻(xiàn)

[1]Eupatilin,a pharmacologically active flavone derived from Artemisia plants,induces cell cycle arrest in ras-transformed human mammary epithelial cells.Do-Hee Kim;;Hye-Kyung Na;;Tae Young Oh;;Won-Bae Kim;;Young-Joon Surh.Biochemical Pharmacology,2004

[2]Acacetin-induced cell cycle arrest and apoptosis in human non-small cell lung cancer A549 cells.Ya-Ling Hsu;;Po-Lin Kuo;;Chi-Feng Liu;;Chun-Ching Lin.Cancer Letters,2004

[3]Potential toxicity of flavonoids and other dietary phenolics:significance for their chemopreventive and anticancer properties.Giuseppe Galati;;Peter J O'Brien.Free Radical Biology and Medicine,2004

[4]Expression of survivin mRNA associates with apoptosis,proliferationand histologically aggressive features in hepatocellular carcinoma.Soichiro Morinaga;;Yoshiyasu Nakamura;;Naoki Ishiwa;;Takaki Yoshikawa;;Yoshikazu Noguchi;;Yuji Yamamoto;;Yasushi Rino;;Toshio Imada;;Yoshinori Takanashi;;Makoto Akaike;;Yukio Sugimasa;;Shoji Takemiya.Oncology Reports,2004

[5]張世蘋.甘草素誘導(dǎo)人肝癌SMMC-7721細(xì)胞凋亡及其機制的研究[D].南京醫(yī)科大學(xué),2009.