背景[1-5]
在后基因組(post-genomics)時(shí)代,基因的表達(dá)產(chǎn)物蛋白質(zhì)作為生物功能最直接的執(zhí)行者和體現(xiàn)者,在生物集體的生理及病理中扮演著重要的角色。高通量的蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)可以在上述過程中篩選出具有潛在價(jià)值的生物標(biāo)記和靶點(diǎn)。
但是長(zhǎng)期以來,大規(guī)模的蛋白質(zhì)表達(dá)分析譜并沒有顯著的提升我們對(duì)生物標(biāo)志物的認(rèn)識(shí),其主要原因是差異蛋白的分析結(jié)果缺乏足夠快速和規(guī)?;尿?yàn)證。為了達(dá)到對(duì)候選蛋白快速驗(yàn)證,蛋白質(zhì)互作驗(yàn)證服務(wù)出一系列蛋白質(zhì)組學(xué)下游驗(yàn)證服務(wù),真正做到“一站式蛋白質(zhì)組學(xué)服務(wù)”。蛋白質(zhì)間的相互作用構(gòu)成了細(xì)胞生化反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)的一個(gè)主要組成部分,蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)與轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)對(duì)調(diào)控細(xì)胞及其信號(hào)有重要意義。
蛋白質(zhì)互作驗(yàn)證服務(wù)相關(guān)技術(shù):
1.免疫共沉淀技術(shù)
免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation)是以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎(chǔ)的用于研究蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法。是確定兩種蛋白質(zhì)在完整細(xì)胞內(nèi)生理性相互作用的有效方法。 其基本原理是:細(xì)胞裂解液中加入抗體,與抗原形成特異免疫復(fù)合物,經(jīng)過洗脫,收集免疫復(fù)合物,然后進(jìn)行SDS-PAGE及Western blotting分析。
但這種方法有兩個(gè)缺陷:一是兩種蛋白質(zhì)的結(jié)合可能不是直接結(jié)合,而可能有第三者在中間起橋梁作用;二是必須在實(shí)驗(yàn)前預(yù)測(cè)目的蛋白是什么,以選擇最后檢測(cè)的抗體,所以,若預(yù)測(cè)不正確,實(shí)驗(yàn)就得不到結(jié)果,方法本身具有冒險(xiǎn)性。
2.pull-down技術(shù)
蛋白質(zhì)相互作用的類型有牢固型相互作用和暫時(shí)型相互作用兩種。牢固型相互作用以多亞基蛋白復(fù)合體常見,通過免疫共沉淀(Co-IP) 、Pull-down技術(shù)或Far-western法研究。Pull-down技術(shù)用固相化的、已標(biāo)記的餌蛋白或標(biāo)簽蛋白(生物素-、PolyHis-或GST-),從細(xì)胞裂解液中釣出與之相互作用的蛋白。通過Pull-down技術(shù)可以確定已知的蛋白與釣出蛋白或已純化的相關(guān)蛋白間的相互作用關(guān)系,從體外傳路或翻譯體系中檢測(cè)出蛋白相互作用關(guān)系。
3.酵母雙雜交系統(tǒng)
酵母雙雜交系統(tǒng)是當(dāng)前廣泛用于蛋白質(zhì)相互作用組學(xué)研究的一種重要方法。其原理是當(dāng)靶蛋白和誘餌蛋白特異結(jié)合后,誘餌蛋白結(jié)合于報(bào)道基因的啟動(dòng)子,啟動(dòng)報(bào)道基因在酵母細(xì)胞內(nèi)的表達(dá),如果檢測(cè)到報(bào)道基因的表達(dá)產(chǎn)物,則說明兩者之間有相互作用,反之則兩者之間沒有相互作用。將這種技術(shù)微量化、陣列化后則可用于大規(guī)模蛋白質(zhì)之間相互作用的研究。在實(shí)際工作中,人們根據(jù)需要發(fā)展了單雜交系統(tǒng)、三雜交系統(tǒng)和反向雜交系統(tǒng)等。此外,酵母雙雜交系統(tǒng)的作用也已擴(kuò)展至對(duì)蛋白質(zhì)的鑒定。
服務(wù)類型[6][7][8]
1.Western Blot技術(shù)服務(wù)
蛋白質(zhì)印記(western blot)又稱免疫印跡(immunoblotting),是通過特異性抗體對(duì)凝膠電泳處理過的細(xì)胞或生物組織樣品進(jìn)行著色,并且通過分析著色的位置和著色深度獲得特定蛋白質(zhì)在所分析的細(xì)胞或組織中的表達(dá)情況的信息。由于western blot具有SDS-PAGE的高分辨力和固相免疫測(cè)定的高特異性和敏感性,現(xiàn)已成為蛋白分析的一種常規(guī)技術(shù),常用于鑒定蛋白,并能對(duì)蛋白進(jìn)行定性和半定量分析。
2.CoIP技術(shù)服務(wù)
免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,CoIP)是以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎(chǔ)的用于研究蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法,用于確定兩種蛋白質(zhì)在完整細(xì)胞內(nèi)生理性相互作用。其原理是:當(dāng)細(xì)胞在非變性條件下被裂解時(shí),完整細(xì)胞內(nèi)存在的許多蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)間的相互作用被保留了下來。如果用蛋白質(zhì)x的抗體免疫沉淀x,那么與x在體內(nèi)結(jié)合的蛋白質(zhì)y也能沉淀下來。這種方法常用于測(cè)定兩種目標(biāo)蛋白質(zhì)是否在體內(nèi)結(jié)合,也可用于確定一種特定蛋白質(zhì)的新的作用搭檔。
CoIP與質(zhì)譜聯(lián)用的原理是:如果一種目標(biāo)蛋白是某一蛋白復(fù)合物的一部分,利用目標(biāo)蛋白的特異性抗體,就可以對(duì)整個(gè)蛋白復(fù)合物進(jìn)行富集,進(jìn)而利用質(zhì)譜鑒定這個(gè)蛋白復(fù)合物中的其他成員。
3.SILAC-based
將SILAC技術(shù)和Co-IP技術(shù)結(jié)合可用于精確定量互作蛋白。其基本原理是通過質(zhì)譜鑒定和分析蛋白質(zhì)相對(duì)量來判斷是否是特異性結(jié)合誘餌蛋白,與對(duì)照組相比較,當(dāng)敲低或者過表達(dá)誘餌蛋白之后,非特異性結(jié)合的蛋白會(huì)成對(duì)出現(xiàn)且峰強(qiáng)一致,而互作蛋白的含量會(huì)相應(yīng)的降低或者升高,通過數(shù)據(jù)差異性分析就可以得到誘餌蛋白互作蛋白信息。
CoIP與質(zhì)譜聯(lián)用的原理是:如果一種目標(biāo)蛋白是某一蛋白復(fù)合物的一部分,利用目標(biāo)蛋白的特異性抗體,就可以對(duì)整個(gè)蛋白復(fù)合物進(jìn)行富集,進(jìn)而利用質(zhì)譜鑒定這個(gè)蛋白復(fù)合物中的其他成員。
參考文獻(xiàn)
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