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哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)

2020/1/10 8:10:46

背景[1-6]

哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)能夠?yàn)橹亟M人源蛋白提供最接近于天然狀態(tài)的翻譯后修飾,在蛋白表達(dá)過程中會形成接近天然蛋白的蛋白質(zhì)折疊和聚合,具備活性蛋白所必須的空間結(jié)構(gòu)和修飾。

由哺乳動物細(xì)胞翻譯后再加工修飾產(chǎn)生的外源蛋白質(zhì),在活性方面遠(yuǎn)勝于原核表達(dá)系統(tǒng)及酵母、昆蟲細(xì)胞等真核表達(dá)系統(tǒng),更接近于天然蛋白質(zhì)。這一特性使得哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)在重組蛋白藥物,特別是治療性重組單抗藥物的研發(fā)和生產(chǎn)中有最為廣泛的應(yīng)用。

哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)勢在于能夠指導(dǎo)蛋白質(zhì)的正確折疊,提供復(fù)雜的N型糖基化和準(zhǔn)確的O型糖基化等多種翻譯后加工功能,因而表達(dá)產(chǎn)物在分子結(jié)構(gòu)、理化特性和生物學(xué)功能方面最接近于天然的高等生物蛋白質(zhì)分子。從最開始以裸露DNA直接轉(zhuǎn)染哺乳動物細(xì)胞至今的30余年間,哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)不僅已成為多種基因工程藥物的生產(chǎn)平臺,在新基因的發(fā)現(xiàn)、蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能研究中亦起了極為重要的作用。

根據(jù)進(jìn)入宿主細(xì)胞的方式,可將表達(dá)載體分為病毒載體與質(zhì)粒載體。病毒載體是以病毒顆粒的方式,通過病毒包膜蛋白與宿主細(xì)胞膜的相互作用使外源基因進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)。常用的病毒載體有腺病毒、腺相關(guān)病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒等。

哺乳動物細(xì)胞表達(dá)載體的必要元件包括:一個高活性的啟動子、轉(zhuǎn)錄終止序列和一個有效的mRNA翻譯信號??梢晫?shí)驗(yàn)需要加入標(biāo)志基因、復(fù)制起始點(diǎn)序列、內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)等。

常用的幾種用于表達(dá)重組蛋白的細(xì)胞株有CHO細(xì)胞、骨髓瘤細(xì)胞株和 COS細(xì)胞、293細(xì)胞等。根據(jù)目的蛋白表達(dá)的時空差異,可將表達(dá)系統(tǒng)分為瞬時、穩(wěn)定和誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)。瞬時表達(dá)系統(tǒng)是指宿主細(xì)胞在導(dǎo)入表達(dá)載體后不經(jīng)選擇培養(yǎng),載體 DNA 隨細(xì)胞分裂而逐漸丟失,目的蛋白的表達(dá)時限短暫;瞬時表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)是簡捷,實(shí)驗(yàn)周期短。

大規(guī)模的瞬時表達(dá)技術(shù)是近年來的一個研究熱點(diǎn),已有報(bào)道能放大到 100L反應(yīng)器中生產(chǎn)重組蛋白,產(chǎn)量(分泌型蛋白)可達(dá) 1-10mg/L。不過該方法技術(shù)條件要求高,如質(zhì)粒的純度、轉(zhuǎn)染的效率等。哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中,重組蛋白的表達(dá)水平與許多 因素相關(guān),如轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控元件、RNA剪接過程、mRNA穩(wěn) 定性、基因在染色體上的整合位點(diǎn)、重組蛋白對細(xì)胞的毒性作 用以及宿主細(xì)胞的遺傳特性等.

應(yīng)用[7][8]

1.部分蛋白在哺乳動物細(xì)胞中的表達(dá)已從實(shí)驗(yàn)室研究邁向生產(chǎn)或中試生產(chǎn)階段。

2.已有許多重要的蛋白及糖蛋白利用哺乳動物細(xì)胞系統(tǒng)表達(dá)和大量制備、生產(chǎn)。如人組織型血纖蛋白酶原激活因子、凝血因子Ⅷ、干擾素、乙肝表面抗原、紅血球生成激素、人生長激素、人抗凝血素Ⅲ,集落刺激因子等。有些產(chǎn)品已投入臨床應(yīng)用或試用。

3.雖然經(jīng)過多年努力,哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)水平有大幅度增高,但從整個水平上看仍偏低,一般處在雜交瘤細(xì)胞單克隆抗體蛋白產(chǎn)率的下限,即1-30μg/l08細(xì)胞/24小時。有人認(rèn)為其限速步驟可囂是在工程細(xì)胞中(對于重組蛋白來講,常是異源的),重組蛋白的分泌效率較低。

參考文獻(xiàn)

[1]Anti‐cell death engineering of CHO cells:Co‐overexpression of Bcl‐2 for apoptosis inhibition,Beclin‐1 for autophagy induction[J].Jae Seong Lee,Tae Kwang Ha,Jin Hyoung Park,Gyun Min Lee.Biotechnol.Bioeng..2013(8)

[2]Rapid construction of transgene-amplified CHO cell lines by cell cycle checkpoint engineering[J].Kyoung Ho Lee,Masayoshi Onitsuka,Kohsuke Honda,Hisao Ohtake,Takeshi Omasa.Applied Microbiology and Biotechnology.2013(13)

[3]Control of IgG LC:HC ratio in stably transfected CHO cells and study of the impact on expression,aggregation,glycosylation and conformational stability[J].Steven C.L.Ho,Esther Y.C.Koh,Miranda van Beers,Monika Mueller,Corrine Wan,Gavin Teo,Zhiwei Song,Yen Wah Tong,Muriel Bardor,Yuansheng Yang.Journal of Biotechnology.2013(3-4)

[4]Rational development of a serum-free medium and fed-batch process for a GS-CHO cell line expressing recombinant antibody[J].Huifeng Zhang,Haibin Wang,Mei Liu,Tao Zhang,Ji Zhang,Xiangjing Wang,Wensheng Xiang.Cytotechnology.2013(3)

[5]Enhancement of recombinant human EPO production and glycosylation in serum-free suspension culture of CHO cells through expression and supplementation of 30Kc19[J].Ju Hyun Park,Zesong Wang,Hee-Jin Jeong,Hee Ho Park,Byung-Gee Kim,Wen-Song Tan,Shin Sik Choi,Tai Hyun Park.Applied Microbiology and Biotechnology.2012(3)

[6]A universal nanoparticle cell secretion capture assay[J].Wendy Fitzgerald,Jean‐Charles Grivel.Cytometry.2012(2)

[7]Simple scale-up of recombinant antibody production using an UCOE containing vector[J].Sabrina Boscolo,Francesca Mion,Marta Licciulli,Paolo Macor,Luca De Maso,Martina Brce,Michael N.Antoniou,Roberto Marzari,Claudio Santoro,Daniele Sblattero.New BIOTECHNOLOGY.2011(4)

[8]The isolation of CHO cells with a site conferring a high and reproducible transgene amplification rate[J].Jonathan J.Cacciatore,Edward F.Leonard,Lawrence A.Chasin.Journal of Biotechnology.2012(2)

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