背景^[1-3]

MARC145](非洲綠猴胚胎腎細(xì)胞)來(lái)源于一非洲綠猴的胚胎腎組織的上皮樣細(xì)胞，從母細(xì)胞(MA-104細(xì)胞)克隆而得到，可連續(xù)傳代培養(yǎng)。此細(xì)胞主要用于病毒的培養(yǎng)，特別是2007年爆發(fā)的豬藍(lán)耳病病毒對(duì)此細(xì)胞尤為敏感，是豬藍(lán)耳病病毒及其防控技術(shù)研究中的重要材料。

MARC145](非洲綠猴胚胎腎細(xì)胞)

MARC145](非洲綠猴胚胎腎細(xì)胞)處理：

1）凍存MARC145](非洲綠猴胚胎腎細(xì)胞)的復(fù)蘇：

將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入到含4-6mL完全培養(yǎng)基的離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心3-5min，棄去上清液，完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。然后將細(xì)胞懸液加入含6-8ml完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶（或皿）中37℃培養(yǎng)過(guò)夜。第二天顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況和細(xì)胞密度。

2）MARC145](非洲綠猴胚胎腎細(xì)胞)傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

對(duì)于懸浮人BURKITT淋巴瘤細(xì)胞，傳代可參考以下方法：

懸浮狀態(tài)下生長(zhǎng)的細(xì)胞，可以通過(guò)向培養(yǎng)瓶中添加完全培養(yǎng)基來(lái)維持細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)，一般情況下細(xì)胞密度維持在1×105~1×10^6個(gè)/mL（不同細(xì)胞對(duì)密度要求不同，）可以維持細(xì)胞的正常生長(zhǎng)。如需分瓶可以將細(xì)胞懸液收集到離心管中1000rpm，離心5min，棄去上清，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后重懸混勻后將細(xì)胞懸液按1：2的比例分到新T25瓶中，添加6-8ml按照說(shuō)明書(shū)要求配置的新的完全培養(yǎng)基以保持細(xì)胞的生長(zhǎng)活力，后續(xù)傳代根據(jù)實(shí)際情況按1:2~1:5的比例進(jìn)行。

3）MARC145](非洲綠猴胚胎腎細(xì)胞)凍存:收到細(xì)胞后建議在培養(yǎng)前3代時(shí)凍存一批細(xì)胞種子以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。

應(yīng)用^[4][5]

MARC145](非洲綠猴胚胎腎細(xì)胞)可以用于豬源唾液酸黏附素介導(dǎo)PRRS病毒感染Marc145細(xì)胞的適應(yīng)性研究

借助CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)Marc145細(xì)胞的基因組進(jìn)行修飾和改造,構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)豬源Sn(p Sn)的Marc145細(xì)胞株(p Sn-Marc145),以期提高PRRSV的細(xì)胞吸附能力及其適應(yīng)性和感染性,為PRRSV的基礎(chǔ)與應(yīng)用研究提供可靠的細(xì)胞平臺(tái)支撐。

【方法】選擇Marc145細(xì)胞第11號(hào)染色體RACGAP1和ASIC1基因之間的內(nèi)含子序列作為打靶區(qū)域。首先,利用生物學(xué)軟件設(shè)計(jì)單向?qū)NA(sg RNA)并構(gòu)建Cas9打靶質(zhì)粒,通過(guò)軟件分析和Surveyor檢測(cè)試劑盒篩選脫靶效率較低的sg RNA;并利用編碼增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(e GFP)的供體質(zhì)粒進(jìn)行同源重組修復(fù),借助熒光顯微鏡觀察、Junction PCR、Southern Blotting等方法來(lái)確定外源基因是否可以特異性重組至靶向區(qū)域并有效表達(dá)。隨后,根據(jù)所選sg RNA,構(gòu)建并比較不同Cas9突變體打靶質(zhì)粒的切割效率;選擇脫靶效率低、切割效率和同源重組較高的Cas9打靶質(zhì)粒用于p Sn-Marc145細(xì)胞的構(gòu)建:在CRISPR/Cas9系統(tǒng)的介導(dǎo)下,將p Sn基因序列經(jīng)供體質(zhì)粒整合至Marc145細(xì)胞基因組中。嘌呤霉素加壓條件下,挑取單克隆細(xì)胞并擴(kuò)大培養(yǎng);對(duì)經(jīng)Junction PCR、Southern Blotting、Western Blotting、間接免疫熒光試驗(yàn)鑒定為陽(yáng)性的克隆進(jìn)行核型分析、細(xì)胞形態(tài)觀察以及生長(zhǎng)周期活性評(píng)估。最終,在正常的Marc145和p Sn-Marc145細(xì)胞上,比對(duì)研究制苗用PRRSV(VR2332、CH1R、R98、JXA1)和野生型PRRSV(GSWW2018和GSKL)的生物學(xué)特性。

【結(jié)果】共設(shè)計(jì)合成了5種sg RNA(sg RNA-3、-17、-23、-24、-33),其中sg RNA-24的脫靶效率最低;該打靶質(zhì)粒能夠?qū)⒐w質(zhì)粒攜載的e GFP定點(diǎn)整合于RACGAP1和ASIC1基因之間的內(nèi)含子中并檢測(cè)到特異性綠色熒光。3種Cas9突變體(p Sp Cas9、Cas9n、e Cas9)中,Cas9n(含雙sg RNA)打靶質(zhì)粒的切割效率最高;將Cas9n(含雙sg RNA)打靶質(zhì)粒和p Sn供體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染正常的Marc145細(xì)胞后,獲得了2株靶向單一整合的p Sn-Marc145重組細(xì)胞(24-15-7、24-15-9),單細(xì)胞陽(yáng)性克隆在保持正常Marc145細(xì)胞遺傳特征和細(xì)胞形態(tài)的同時(shí),表現(xiàn)出更優(yōu)的生長(zhǎng)活性。通過(guò)蝕斑形成試驗(yàn)、間接免疫熒光試驗(yàn)、病毒生長(zhǎng)曲線的繪制、Western Blotting和實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn),盡管p Sn的表達(dá)對(duì)PRRSV疫苗生產(chǎn)用毒種在Marc145細(xì)胞中的毒力和復(fù)制能力影響不大,但顯著提高高致病性PRRSV(HR-PRRSV,JXA1)的吸附能力;通過(guò)傳代培養(yǎng)、遺傳變異分析、實(shí)時(shí)熒光定量PCR、蝕斑形成試驗(yàn)和病毒生長(zhǎng)曲線的繪制發(fā)現(xiàn),2株野生型PRRSV在p Sn-Marc145細(xì)胞上具有明顯強(qiáng)于其在正常Marc145細(xì)胞上的適應(yīng)性和感染性。

【結(jié)論】綜上所述研究結(jié)果表明:一、Marc145細(xì)胞基因組中第11號(hào)染色體RACGAP1和ASIC1基因之間的內(nèi)含子區(qū)域可作為外源基因定點(diǎn)打靶的有效位點(diǎn)。

二、利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)構(gòu)建的p Sn-Marc145細(xì)胞株在HP-PRRSV疫苗生產(chǎn)和野生型PRRSV分離過(guò)程中具有良好的應(yīng)用潛力。

參考文獻(xiàn)

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