背景^[1-3]

PCR產(chǎn)物純化試劑盒是一種用于PCR產(chǎn)物純化或從多種DNA反應體系中純化DNA的試劑盒。

PCR產(chǎn)物純化試劑盒適用于PCR反應后去除引物、酶、礦物油、甘油、鹽等雜質(zhì)；也同樣適用于酶切、連接、磷酸化、補平或切平、隨機引物等反應后的DNA純化。純化所得DNA可直接用于酶切、連接、轉(zhuǎn)化細菌、測序、PCR、雜交等后續(xù)操作。本試劑盒適用于純化100bp-10kb DNA，長至30個堿基的引物均可被完全去除。

PCR產(chǎn)物純化試劑盒

PCR產(chǎn)物純化試劑盒采用了一種新型的DNA純化柱。在特定條件下，使DNA能在離心過柱的瞬間，結合到DNA純化柱上，在一定條件下又能將DNA充分洗脫，從而實現(xiàn)DNA的快速純化。無需酚氯仿抽提，無需酒精沉淀，12個樣品只需不足15分鐘即可完成。

每個DNA純化柱可以結合的DNA量的上限約為15微克。DNA回收效率約為90%。接近100bp或10kb的DNA片段回收效率要略低一些，大于10kb的DNA回收效率迅速下降。另外如果樣品中DNA含量特別低也會導致回收效率下降。

注意事項：

次使用前在溶液II(洗滌液)中加入39ml無水乙醇，混勻，并在瓶上做好標記。

溶液I對人體有刺激性，操作時請小心，并注意適當防護以避免直接接觸人體或吸入體內(nèi)。

本試劑盒所有操作均在室溫進行，操作時無需冰浴。所有離心也均在室溫進行。

廢液收集管在一次抽提中需多次使用，切勿中途丟棄。

應用^[4][5]

用于建立東海幾種重要赤潮藻的LAMP-LFD檢測技術的研究

以東海常見的3種赤潮藻,即強壯前溝藻（Amphidinium carterae）、鏈狀亞歷山大藻（Alexandrium catenella）和米氏凱倫藻（Karenia mikimotoi）為目標,將環(huán)介導等溫擴增（loop–mediated isothermal amplification,LAMP）與橫向流動試紙條（lateral flow dipstick,LFD）結合,分別建立其LAMP–LFD檢測技術。論文以目標藻轉(zhuǎn)錄內(nèi)間隔區(qū)（internal transcribed spacers,ITS）或核糖體大亞基（large subunit,LSU）為檢測靶標,首先通過基因組DNA提取和克隆測序獲得靶序列,根據(jù)靶序列進行LAMP引物和檢測探針的設計、合成與篩選;其次,建立目標藻的LAMP–LFD檢測體系,對LAMP反應體系進行優(yōu)化;最后對LAMP–LFD技術的特異性、靈敏度及實用性進行驗證評估。

對強壯前溝藻的ITS序列進行克隆,并用其設計1套LAMP引物及1條檢測探針;對LAMP反應體系進行優(yōu)化后用我國東海沿岸常見微藻作為受試對象,對LAMP–LFD進行交叉反應測試,表明LAMP–LFD對強壯前溝藻具有特異性;分別以強壯前溝藻基因組DNA和ITS克隆質(zhì)粒為模板進行靈敏度測試,顯示LAMP–LFD的檢測限分別為8.34×10-44 ng·μL-1和1.86×10~4 copies·μL-1,靈敏度均比常規(guī)PCR高100倍;模擬自然水樣測試得LAMP–LFD對目標藻的檢測限為約10 cells·mL-1,靈敏度比常規(guī)PCR高10倍。

對鏈狀亞歷山大藻ITS序列進行克隆,以其為靶序列成功設計3套LAMP引物（AcLF1、AcLF2和AcLF3）,篩選確定引物AcLF2,并設計1條檢測探針;用引物建立檢測體系并進行優(yōu)化;交叉反應測試顯示LAMP–LFD對鏈狀亞歷山大藻具有特異性;LAMP–LFD對鏈狀亞歷山大藻基因組DNA和ITS克隆質(zhì)粒的檢測限為4.63×10-4ng·μL-1和1.26×10~4copies·μL-1,均顯示其靈敏度比常規(guī)PCR高100倍;模擬水樣測試顯示,LAMP–LFD對目標藻的檢測限約為10-11 cells·mL-1,靈敏度較常規(guī)PCR高100倍?？寺∶资蟿P倫藻ITS序列,并用其設計2套LAMP引物（KmLF1和KmLF2）,用實驗室前期獲得的LSU序列再設計2套引物（KmLF3和KmLF4）,對4套引物進行篩選確定引物KmLF3,并根據(jù)LSU序列設計1條檢測探針;優(yōu)化建立的LAMP體系;交叉反應測試得LAMP–LFD能特異性地檢測米氏凱倫藻;LAMP–LFD對米氏凱倫藻基因組DNA的檢測限為1.70×10-4ng·μL-1,靈敏度較常規(guī)PCR高100倍,對米氏凱倫藻LSU克隆質(zhì)粒檢測限為6.21×10~3copies·μL-1,其靈敏度是LAMP和SYBR Green I染料的10倍,是常規(guī)PCR的1000倍;模擬水樣檢測得LAMP–LFD檢測限約為10-11 cells·mL-1,其靈敏度是常規(guī)PCR的1000倍。綜上所述,建立的LAMP–LFD檢測方法是一種快速準確的赤潮藻分子檢測技術。

參考文獻

[1]The development of loop-mediated isothermal amplification combined with lateral flow dipstick for detection of Karlodinium veneficum[J].Hai-Long Huang,Peng Zhu,Cheng-Xu Zhou,Shan He,Xiao-Jun Yan.Harmful Algae.2017

[2]Understanding how physical-biological coupling influences harmful algal blooms,low oxygen and fish kills in the Sea of Oman and the Western Arabian Sea[J].Paul J.Harrison,Sergey Piontkovski,Khalid Al-Hashmi.Marine Pollution Bulletin.2017(1)

[3]Rapid and sensitive detection of Babesia bovis and Babesia bigemina by loop-mediated isothermal amplification combined with a lateral flow dipstick[J].Yimin Yang,Qun Li,Suhua Wang,Xueqiu Chen,Aifang Du.Veterinary Parasitology.2016

[4]Hyperbranched rolling circle amplification as a novel method for rapid and sensitive detection of Amphidinium carterae[J].Guofu Chen,Panpan Cai,Chunyun Zhang,Yuanyuan Wang,Shibei Zhang,Changlu Guo,Dou Ding Lu.Harmful Algae.2015

[5]王亮.建立東海幾種重要赤潮藻的LAMP-LFD檢測技術[D].哈爾濱工業(yè)大學,2018.